VİROLOJİ

Koryo-allantoik boşluğa hava kesesi tarafından virus ekimi yöntemi rutin olarak kanatlı hayvanlarda görülen Newcastle hastalığı virusunun üretilmesinde kullanılmakta olup, ekim için 9-11 günlük embriyolu tavuk yumurtaları tercih edilmektedir. • Embriyolu yumurtalar ışık kaynağı altında incelenerek hava kesesinin sınırları ve embriyonun bulunduğu bölge kurşun kalemle işaretlenir (Resim 3.3).

Koryo-allantoik boşluğa hava kesesi tarafından virus ekimi yöntemi rutin olarak kanatlı hayvanlarda görülen Newcastle hastalığı virusunun üretilmesinde kullanılmakta olup, ekim için 9-11 günlük embriyolu tavuk yumurtaları tercih edilmektedir. • Embriyolu yumurtalar ışık kaynağı altında incelenerek hava kesesinin sınırları ve embriyonun bulunduğu bölge kurşun kalemle işaretlenir (Resim 3.3). • Ekim yapılacak bölge sırasıyla tentürdiyot ve alkolle dezenfekte edilir • Özel delici kullanılarak ekim noktasına iğnenin girebileceği büyüklükte bir delik açılır. • Uzun uçlu bir iğne ile girilerek embriyonun olmadığı yöne doğru 45° açı ile ilerlenir. • 0,2 ml virus ekilerek enjektör dikkatlice geri çekilir.

Direkt olarak dokulardan ayrıştırılarak elde edilen hücrelerin in vitro şartlarda üretilmesi ile elde edilen kültürler primer hücre kültürü olarak adlandırılır. Bu kültürler virus izolasyon çalışmalarında yüksek duyarlılık sağlar. Hücre kültürü şişelerinde (flask) üretilen hücrelerin üretildiği ortamdan kaldırılarak yeni kültür şişelerine aktarılması ve böylece miktar olarak çoğaltılması subkültür hazırlama (veya pasaj), elde edilen yeni kültürler ise subkültür olarak tanımlanır (Resim 3.4). Primer hücre kültürleri belli bir pasaj seviyesinden sonra morfolojik özelliklerini ve üreme yeteneklerini kaybetmeye başlarlar. Primer kültürlerin pasajlanmasıyla elde edilen ve genetik özellikleri bakımından köken aldığı dokuya en az %85 oranında benzerlik gösteren bu kültürlere diploid hücre kültürü denir. Diploid hücre kültürleri genellikle 20 pasaj seviyesine kadar ilerletilebilir. Daha sonra bu hücrelerde de üreme yeteneğinin azalması ve morfolojik değişiklikler başlar. Sonsuz sayıda pasajı yapılabilen ve genetik olarak köken aldığı dokudan tamamen farklılaşmış olan hücre kültürlerine ise devamlı hücre kültürü denir. Devamlı hücre kültürleri primer kültürlerin yaklaşık 70 kez pasajlanmasından sonra elde edilebilir.

Hücre kültürleri üretildikleri ortamlara göre stationer kültürler ve süspanse kültürler olmak üzere ikiye ayrılır. 1. Stationer Kültürler: Bu tip hücre kültürlerinde hücreler kültür kabı yüzeyine tutunarak çoğalırlar. İnkübatör raflarında (sabit kültür) veya özel bir düzenekle dönen bir sistem içerisinde (roller kültür = dönen kültür) inkübe edilebilirler (Resim 3.5). Roller kültürler şişelerde veya tüplerde hazırlanabilir. Stationer kültürlerde hücreler çoğunlukla kültür kabı yüzeyini tek tabaka halinde kaplamaktadır. Buna monolayer hücre kültürü denir. Hücrelerin monolayer tabakalanması özellikle virusların üretilmesi sırasında oluşacak sitopatolojik değişiklikleri (CPE) takip edebilmek açısından önemlidir. 2. Süspanse Kültürler: Bu tip kültürlerde hücreler kültür kabına tutunmadan hücre üretme vasatı içerisinde süspanse haldeyken çoğalmaktadır.

Hücrelerin Dondurulması

Dondurulan Hücrelerin Çözülmesi • Derin dondurucudan çıkarılan hücreler 37 °C’ ye ayarlanmış su banyosunda hızla çözdürülür • 5-10 ml vasat içerisinde pipete edilen hücreler 1200 devir/dk hızda 10 dk süreyle santrifüj edilir • Süpernatant atılır. Hücre peleti vasatla sulandırılıp süspanse hale getirilir ve daha önce hazırlanmış hücre kültür şişelerine geçilir • Hücre kültürünün üretilmesi ve takibi 37 °C’ye ayarlanmış inkübatörlerde yapılır.

Adsorbsiyonlu Yöntemle Virus Ekimi