LABORATUVAR GEREKSİNİMLERİ VE TEMEL UYGULAMALAR

Yapılan çalışmalar sırasında dış ortamdaki mikroorganizmaların çalışma ortamına ve çalışma yapılan materyale bulaşmasını engellemeye yönelik tedbirlerin uygulanmasına aseptik teknik denir.

Viral hastalıklar insanları etkilemeleri ve oluşturdukları potansiyel sağlık riskleri esas alınarak dört biyolojik güvenlik derecesine ayrılmıştır (biosafety level, BSL 1-4). Paralel olarak bu virusların çalışılabileceği laboratuvarlar da dört güvenlik derecesine ayrılmış (BSL 1-4) ve her bir seviye için gerekli temel şartlar belirlenmiştir. Bu sayede özellikle epidemik&pandemik karaktere sahip olan veya geniş çapta halk sağlığı tehdidi yaratabilecek hastalık etkenlerinin güvenli bir şekilde çalışılabilmesi mümkün olmaktadır. Rutin viroloji laboratuvarları BSL-1 ve BSL-2 düzeyinde yer alır. BSL-1 sınıfı laboratuvarlarda çoğunlukla açık masalarda ve özel bir güvenlik tedbiri gerektirmeyen standart yöntemlerle çalışılır. BSL-2 sınıfı laboratuvarlarda insanlar için risk oluşturabilen etkenler de çalışılabilmektedir. Bu sebeple gerektiğinde kullanılabilecek biyogüvenlik tedbirleri (özel laboratuvar giysileri, atık yönetim sistemi vb) ve tip-2 biyogüvenlik kabinleri bulunur. BSL-3 ve BSL-4 sınıfı laboratuvarlar ise çok tehlikeli, ölümcül seyirli salgınlara yol açabilecek ve egzotik karakterdeki enfeksiyöz etkenlerin (biyolojik silahlanmada kullanılan ajanlar vb) çalışılabilmesine uygun olarak tasarlanmıştır. Bu laboratuvarlarda görevli olan personel pozitif basınçlı giysilerle çalışır. Laboratuvar ortamına ise negatif basınç uygulanmaktadır. Böylece dış çevrenin kontaminasyonu engellenmiş olur. Bu laboratuvarlarda çalışma öncesi ve sonrasında tüm giysiler değiştirilir ve duş alınır. Laboratuvar giysileri, tüm ekipman ve atıklar dekontamine edilir.

Sterilizasyon, bir cismin veya biyolojik bir maddenin üzerinde veya içeriğinde bulunan patojen veya apatojen tüm mikroorganizmaların yıkımlanması (öldürülmesi) veya elimine edilmesi işlemidir. Sterilizasyon işlemi ısı, ışın, gaz ve filtrasyon uygulamaları ile gerçekleştirilebilir. 

Biyogüvenlik kabinleri ve küçük odalar tarzında düzenlenmiş mekanlarda bulunan laboratuvar masaları uygun konumda yerleştirilen ultraviyole ışık kaynağı ile strerilize edilir. Ultraviyole ışıkla sterilizasyon aynı zamanda plastik türevi malzemelerin sterilizasyonu için de uygundur. Cam ve metal malzemeler otoklavda veya sterilizatörde (160-180°C) steril edilebilir. Plastik malzemelerin yüksek ısıya dayanma dereceleri farklıdır. Bu nedenle polipropilen malzemeden imal edilmiş plastik türevi bazı laboratuvar malzemeleri de otoklavda steril edilebilmektedir.

Sterilizasyonda ortamda bulunan tüm mikroorganizmalar hedef alınırken dezenfeksiyonda sadece hastalık etkeni olan (patojen) mikroorganizmalar hedef alınmaktadır.

Soğutmalı santrifüjler; standart veya yüksek devirli santrifüjlere soğutma ünitesinin eklenmesiyle tasarlanmış cihazlardır. Bu sayede ortam sıcaklığının istenilen değerlere (örneğin; +4°C) ayarlanması ve özellikle biyolojik ürünlerin zarar görmeden santrifüj edilebilmesi mümkün olmaktadır. 

Ultrasantrifüjler, süspansiyon halinde bulunan çok küçük moleküllerin dahi çöktürülerek ayrılmasına olanak sağlayan çok yüksek devirli santrifüjlerdir. Dakikada 150.000 devir hıza ulaşabilen ultrasantrifüjler bulunmaktadır. Ultrasantrifüjler kullanılarak viruslar çöktürülebileceği gibi; nükleik asitler, hücre zarı, hücre çekirdeği ve mitokondri gibi hücresel bölümler ve değişik proteinler de çöktürülebilir.

Tip 1 (klasik) ve Tip 2 (mikrobiyolojik) biyogüvenlik kabinleri

Tip-1 biyogüvenlik kabinleri çalışma ortamını ve yapılan işi kontaminasyonlardan korurken, Tip-2 biyogüvenlik kabinleri aynı zamanda çalışan kişiyi ve çevreyi de çalışılan materyalden kaynaklanabilecek risklere karşı korumaktadır. Yüksek güvenlik şartları sağlayan Tip-3 ve Tip-4 biyogüvenlik kabinleri ise özellikle egzotik ve zoonotik hastalık etkenlerinin çalışılması sırasında gereklidir.

Klasik ışık mikroskoplarında ışık kaynağı altta objektifler üstte yer alır. İnvert ışık mikroskoplarında ise ışık kaynağı üstte, objektif alttadır.

Viroloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan üç tip homojenizatör vardır. Katı materyalleri homojen hale getirmek amacıyla havan ve doku parçalayıcı kullanılır. Süspansiyon halindeki partiküllerin homojenizasyonunda ise ses dalgaları yayarak çalışan ultrasonik homojenizatör’den yararlanılır.

Otoklavlar katı (cam, metal vb) ve sıvı materyallerin sterilizasyonu amacıyla kullanılabilir. Bu amaçla en sık kullanılan otoklavlama koşulları 121°C sıcaklıkta 1 atmosfer basınç altında 15-20 dk süreyle uygulanan işlemlerdir.

 Sterilizatörler

• Biyolojik materyallerin çalışılmasında cam pipetler kullanılırken mutlaka menisküs çizgisi takip edilmelidir. Hacim ölçülürken menisküs çizgisinin tabanı ölçmek istediğimiz değerin hizasında olmalıdır.
• Cam pipetler kullanılırken kesinlikle ağızla pipetasyon yapılmamalı, mutlaka akülü pipet tutucular veya manuel pipetörler kullanılmalıdır.
• Cam pipetler kullanılırken pipetteki sıvı hiçbir zaman dik pozisyonda boşaltılmamalıdır. Bu durumda damlacık (aerosol) oluşumuna ve çalışma ortamının kontaminasyonuna yol açılabilir. Bunun yerine pipet içindeki sıvı kabın duvarına doğru boşaltılmalıdır.

Bu yöntemde standart olarak 165°C’de 2 saat kuru ısı uygulanması öngörülmektedir. Ancak son dönemlerde yapılan araştırmalarda bu uygulamanın bazı bakteriler için yeterli olmayabileceği ve sıcaklık değerinin 180°C’ye çıkarılması gerektiği belirlenmiştir.

• Sterilize edilecek malzemelerin uygun şekilde paketlenmesi gerekir. Bu amaçla kağıt veya polipropilen malzemeden üretilmiş otoklav torbaları kullanılır.
• Şişeler ve şişe içerisinde sterilize edilecek sıvı malzemeler söz konusu ise; şişe kapağı tam kapatılmadan otoklava konulmalıdır. Otoklavlama işlemi bittikten sonra bu kapaklar sıkılmalıdır.
• Sterilize edilecek malzemeye uygun sıcaklık ve süre değerleri belirlenmelidir.
• Malzemeler otoklava yerleştirilmeden önce mutlaka üzerine otoklav bandı yapıştırılmalıdır.
• Organik bileşik içermeyen vasatlar (örneğin; PBS) otoklavda steril edilebilir. Ancak hücre kültürü vasatları ve diğer organik bileşikler içeren vasatlar otoklavla steril edilmemelidir.
• Kontamine ve temiz materyaller birlikte steril edilmemelidir.
• Sıvı materyaller ile katı malzemeler bir arada steril edilmemelidir. Elektronik donanımlı cihazlarda genellikle farklı nitelikteki malzemeler için uygulanan farklı programlar hazırlanmıştır. Yapılacak uygulama için doğru programların seçilmesine dikkat edilmelidir.

Ultraviyole (UV) ışınları ise penetrasyon yeteneğine sahip değildir ve sadece yansıdığı yüzeylerde etkinlik gösterebilir. Ultraviyole ışınlarının sterilizasyon etkinliği ultraviyole lambasının gücü ile doğru orantılıdır. Ayrıca lambadan uzaklaştıkça strerilizasyon etkisi de azalmaktadır. Ultraviyole ışın ile sterilizasyonun değişik kullanım alanları söz konusudur. Örneğin; çalışma tezgahlarının, yüzeylerin ve laboratuvar ortamındaki havanın sterilizasyonunda ultraviyole ışınlar kullanılmaktadır. Ayrıca ısı uygulamasından etkilenen plastik malzemelerin sterilizasyonunda da ultraviyole ışından yararlanılmaktadır.

Etilen oksit

Sterilizasyon uygulamalaında 0,2 µm por büyüklüğüne sahip olan filtreler tercih edilir.

Santrifüj işleminde iki fazın ayrılması için uygulanması gerekli olan güce relatif santrifüj kuvveti (RCF, relative centrifugal force) denir. RCF değeri yerçekimi kuvvetinin (g) katları ile ifade edilir (örneğin; 1500x g veya 3000x g).

Çökeltiye sediment, sıvı kısma süpernatant adı verilmektedir.