VETERİNER LABORATUVAR TEKNİKLERİ VE PRENSİPLERİ

ELİSA; enzimle işaretli antijen ya da antikorun serbest antijen ya da antikor ile reaksiyona girmesi ve oluşan antijen antikor kompleksinin enzim aktivitesinin enzime spesifik substrat varlığında ortaya konması esasına dayanan ölçüm tekniğidir.

RIA, bir izotopla işaretli antijenin, işaretlenmemiş antijenle yarışmaya girerek antikorla bağlanmasına dayanır. IRMA yönteminde ise işaretli antijen yerine, saflaştırılmış ve işaretlenmiş antikor kullanılmaktadir. CPB, belirli bir antikor yerine belirli bir hormon veya hormon sınıfına özgül affinitesi olan doğal plazma proteinleri (genellikle immunglobulin haricindeki globulinler tercih edilir) kullanılır.

Elektroforetik hareketlilik net yükle doğru, molekül büyüklük ve akışkanlık ile ters orantılıdır.

Elektroforez esnasında sisteme akım uygulandığında destek ortamına bağlı olan iyonlar sabit kalır fakat bunlarınn etrafında kümelenmiş olan diğerleri kendilerinin aksi kutbuna serbestçe hareket etmeye başlarlar. İyonlar yüksek oranda hidratize olduğundan kendilerinin hareketi içinde yer aldıkları çözücününde hareket etmesine neden olur. Bu fenomen endozmoz olarak tanımlanır ve bu olay sonucunda su tek yönde hareket eder.

Kağıt elektroforezde ayırım süresi uzundur (14-16 saat) ve oldukça fazla artalan etkileşimi görülür. Nişasta jeli, tekrarlanabilir şekilde elde etmek zordur. Selüloz asetat membranların kullanmadan önce tamponla ıslatılması ve dansitometrik miktar tayininden önce berraklaştırılması gerektiğinden, rutinde kullanımı nadirdir. Günümüzde agaroz ve poliakrilamid jel elektroforezi yaygın olarak kullanılmaktadır.

Elektroforetik ayırım ve boyamanın ardından oluşan gözle görünür protein alanlarını direk dansitometri ile yüzde olarak ya da örneğin toplam protein miktarı bilindiği taktirde, mutlak değer olarak belirtmek mümkün olabilmektedir.

Kromatografide sabit faza ilgisi daha çok olan analitler daha yavaş göç ederken, az olanlar daha hızlı hareket ederler. Bu nedenle sabit faza ilgisi en az olan C maddesi en hızlı, en fazla olan A maddesi ise yavaş ilerler.

Çözünen maddelerin birbirine karışmayan iki sıvı arasında dağılımı partisyon kromatografinin temelini oluşturur. İşlemsel olarak sıvılardan bir tanesi sabit fazı oluşturur. Bu fazın oluşturulması için ince tabaka sıvı destek materyali üzerine veya kapiller kolonun iç yüzüne adsorbe edilir. Ayırım çözünen maddelerin sabit ve hareketli faz arasında göreceli çözünme yeteneğine bağlı olarak şekillenir.

Moleküler antijenin eşsiz biçimde tamamlayıcı antikor tarafından bağlandığı bölgeye epitop (antijenik determinant) denmektedir.

Imunojenite için gerekli özellikler aşağıda sıralanmıştır.
1. Molekül içinde kararlı yapıların var olması
2. Yapının rastlantısallığı
3. Molekül ağırlığının en za 4000-5000 Da olması
4. Metabolize olabilme yeteneği
5. Immunojenik konfigurasyonun antikor oluşturan mekanizmalara erişebilirliği
6. Yapısal olarak yabancılığı.

ELISA enzimle işaretli antijen ya da antikorun serbest antijen ya da antikor ile reaksiyona girmesi ve oluşan antijen antikor kompleksinin enzim aktivitesinin enzime spesifik substrat varlığında ortaya konması esasına dayanan ölçüm tekniğidir.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) tekniği sayesinde DNA molekülünün belirlenen bir bölümü çok fazla sayıda kopyalanır.

Elektroforez, çeşitlilik arz eden ve iyonize olabilen analitlerin ayırımına yönelik çok yönlü ve güçlü analitik tekniktir.

Artı ya da eksi yük taşıyabilen moleküller amfolit olarak anılır ve kendi izoelektrik noktalarından (pI) daha asidik ortamda bulunanlar artı yük alarak (proton bağlayarak)
katoda göç ederler.

Göç etme hızı; molekülün net yükü, molekülün büyüklüğü ve şekli, elektriksel alan şiddeti, destek materyalinin özelliği ve çalışma ısısı gibi faktörlerden etkilenir.

Isı = (E)(I)(t)
Denklemde
E = volt cinsinden EMF
I = amper cinsinden akımı
t = saniye cinsinden zamanı ifade eder.

Agaroz jel elektroforezi özellikle serum proteinlerinin, hemoglobin alt gruplarının, laktat dehidrogenaz izoenzimlerinin, lipoprotein fraksiyonlarının ve diğer maddelerin analizinde kullanılır.

Konvansiyel elektroforez; ayırım, boyama, tespit ve miktar tayini başlıklarından oluşur.

Kromatografik ayırımın sınıflandırılması, çözünen maddelerin fiziksel veya kimyasal özelliklerine göre yapılmaktadır. Bunlar iyon değişim, bölümleme (partisyon), soğurma (adsorbsiyon), boyut dışlama (jel filtrasyon) ve affinite kromatografileridir. Klinik laboratuvar uygulamalarında en çok iyon değişim ve partisyon kromatografi teknikleri kullanılmaktadır.

Affinite kromatografide analit ve bağlayıcı molekülün biribiri ile eşsiz bir biçimde bağlanması yöntemin esasını oluşturur. Enzim-substrat, hormon-reseptör veya antijen antikor etkileşimleri bu teknikte kullanılmaktadır.