VETERİNER LABORATUVAR TEKNİKLERİ VE PRENSİPLERİ

Agaroz jel elektroforezi özellikle serum proteinlerinin, hemoglobin alt gruplarının, laktat dehidrogenaz izoenzimlerinin, lipoprotein fraksiyonlarının ve diğer maddelerin analizinde kullanılır. Agaroz jel, rutin analizlerde kullanılabilirlik ve çok yönlülük yönünden selüloz asetata eşdeğer kabul edilmektedir. Agaroz gözenek büyüklüğünün fazla oluşu ve proteinlerin buralardan sekteye uğramaksızın geçmesi ayırımı tamamen yükün kütleye oranına dayandırmaktadır. Agaroz jelin en önemli avantajı, proteinlere karşı affinitesinin düşük olması ve kuruduktan sonra gösterdiği doğal berraklığıdır. İyonize olan gruplardan temel olarak yoksundur ve hafif endozmotik karakter gösterir.

Agaroz jel elektroforezi özellikle serum proteinlerinin, hemoglobin alt gruplarının, laktat dehidrogenaz izoenzimlerinin, lipoprotein fraksiyonlarının ve diğer maddelerin analizinde kullanılır. Agaroz jel, rutin analizlerde kullanılabilirlik ve çok yönlülük yönünden selüloz asetata eşdeğer kabul edilmektedir. Agaroz gözenek büyüklüğünün fazla oluşu ve proteinlerin buralardan sekteye uğramaksızın geçmesi ayırımı tamamen yükün kütleye oranına dayandırmaktadır. Agaroz jelin en önemli avantajı, proteinlere karşı affinitesinin düşük olması ve kuruduktan sonra gösterdiği doğal berraklığıdır. İyonize olan gruplardan temel olarak yoksundur ve hafif endozmotik karakter gösterir.

Kağıt Elektroforezi Geçmişte serum proteinlerini ayırmada destek ortamı olarak yoğun olarak kullanılıştır. Günümüzde bu destek materyalinin yerini selüloz asetat veya agaroz jel almıştır. Kağıt elektroforezde ayırım süresi uzundur (14-16 saat) ve oldukça fazla artalan etkilşimi görülür. Bu olumsuz faktörlere rağmen, geçmşte yoğun kullanılmasının nedeni, destek ortamı olarak kolay elde edilebilirliği ve gerilme direncinin yüksek oluşudur.

Kromatografik ayırımın sınıflandırılması , çözünen maddelerin fiziksel veya kimyasal özelliklerine göre yapılmaktadır. Bunlar iyon değişim, bölümleme (partisyon), soğurma (adsorbsiyon), boyut dışlama (jel filtrasyon) ve affinite kromatografileridir. Klinik laboratuvar uygulamalarında en çok iyon değişim ve partisyon kromatografi teknikleri kullanılmaktadır.

İyon Değişim Kromatografi, yüklü yüzey moleküllerine sahip sabit faz ile bunun zıt yüküne sahip hareketli faz arasında iyonların yer değişimi esasına dayanır. Şartlara bağlı olarak çözünmüş maddeler ya katyon (artı yüklü) ya da anyon (eksi yüklü) olarak bulunurlar. Ayırım, taşınan yüklerin fark ve miktarına dayanır. İşlemsel olarak sabit faz olarak görev yapan silika parçacıkları veya reçinenin yüzeylerine, anyonik veya katyonik yükleri sağlayan fonksiyonel gruplar bağlanır. Elektro-kimyasal nötrlüğü sağlamak için ters iyon (counter ion) olarak tanımlanan takas iyonu, sabit yüklere çok yakın konumda bulunur ve hareketli fazda yer alan çözünmüş iyonlar ters iyonlar ile yer değiştirirler.

Partisyon Kromatografi:Çözünen maddelerin birbirine karışmayan iki sıvı arasında dağılımı partisyon kromatografinin temelini oluşturur. İşlemsel olarak sıvılardan bir tanesi sabit fazı oluşturur. Bu fazın oluşturulması için ince tabaka sıvı destek materyali üzerine veya kapiller kolonun iç yüzüne adsorbe edilir. Ayırım çözünen maddelerin sabit ve hareketli faz arasında göreceli çözünme yeteneğine bağlı olarak şekillenir.

Boyut Dışlama Kromatografisi (Jel Filtrasyon): Bu kromatografi çeşidi aynı zamanda jel filtrasyon, moleküler eleme, sterik eleme ve jel nüfuz kromatografisi olarak da bilinmekte olup moleküllerin büyüklüklerine göre ayrımını sağlar. Molekülün şekli ve hidratize formda bulunması işlemin sonuçlarını etkilemektedir. Sabit faz olarak çok çeşitli materyaller kullanılabilmektedir. Bunlar çapraz bağlı dekstran, poliakrilamid, agaroz, polystrene-divinilbenzen gözenekli cam veya bunların farklı kombinasyonlarıdır. Bu materyallerin tanecikleri gözeneklidir ve küçük moleküller gözeneklerde geçici olarak yakalanır. Gözeneklere giremeyecek kadar büyük olan moleküller ise tutulmadan mobil faz ile beraber kolonu terk eder. Orta boydaki moleküller gözeneklerin bir kısmında geçiçi süre ile tutulurlar ve kolonu büyüklerden sonra, fakat küçük moleküllerden önce terkederler. Bu tip kromatografi analitik olmaktan çok örnek hazırlamaya yöneliktir.

Immunelektroforez Proteinlerin elektroforez tekniği ile ayırımını takiben antikorlar ile reaksiyona girmesine dayanan biyokimyasal yöntemlere genel olarak immunelektroforez denilmektedir.

ELISA çeşitleri iki grupta incelenebilmektedir.

1. Yarışmalı teknikler

a) Antijen-enzim konjugatını kullanan teknik

b) Antikor-enzim konjugatını kullanan teknik

2. Yarışmalı olmayan teknikler

a) Çift antikor sandviç tekniği

b) Modifiye çift antikor sandviç tekniği

c) İndirekt teknik

Çift Antikor Sandviç Tekniği:

Teknikte iki antikor kullanılmaktadır ve ikinci antikor enzimle işaretlenmiştir.

İlk antikor ile katı faz kaplanmaktadır.

Örnek ilavesinden sonra antijen antikor kompleksi oluşması sağlanır ve ardından işaretli antikor ilave edilir.

En son substrat ilave edilerek renk oluşumu gerçekleştirilir.

Oluşan rengin şiddeti test antijeninin konsantrasyonu ile orantılıdır.

Elektroforez, çeşitlilik arz eden ve iyonize olabilen analitlerin ayırımına yönelik çok yönlü ve güçlü analitik tekniktir. Yük taşıyan çözünmüş maddeler veya parçacıkların sıvı ortamda elektriksel alanın etkisiyle göç etmesi elektroforez tekniğinin kapsamını oluşturur.

Göç etme hızı; molekülün net yükü, elektriksel alan şiddeti, çalışma ısısı,destek materyalin özelliği gibi faktörlerden etkilenir.

Net tük ve destek materyalin gözenek çapı ile doğru, molekül büyüklük ve akışkanlık ile ters orantılıdır.

Elektroforetik işlemde tampon çözeltilerin birden fazla görevi bulunmaktadır. Bunlar; akımı iletmek, elektroforezin gerçekleştirildiği pH yı oluşturmak, çözünen analitin yükünü belirlemek olarak sıralanabilir.

Elektroforezde kullanılan destek ortamlarının bazıları suyla temas ettiğinde hidroksil iyonlarını adsorbe ederek negatif yüklenir. İyonlar yüzeye bağlanarak hare- ketsiz kalır. Çözeltide var olan pozitif iyonlar bu eksi yüklü sabit bölgeler etrafında kümelenerek bulut meydana getirirler. Bulutla ilişki halinde bulunan negatif iyon miktarı sabitlenmiş halde bulunan negatif iyonlardan uzaklaştıkça artar ve sonunda her iki iyon konsantrasyonu eşitlenerek dengeye ulaşır. Sisteme akım uygulan- dığında destek ortamına bağlı olan iyonlar sabit kalır fakat diğerleri kendilerinin aksi kutbuna serbestçe hareket etmeye başlarlar. İyonlar yüksek oranda hidratize olduğundan kendilerinin hareketi içinde yer aldıkları çözücününde hareket etmesine neden olur. Bu fenomen endozmoz olarak tanımlanır ve bu olay sonucunda su tek yönde hareket eder.

Jel filtrasyonda moleküllerin büyüklüklerine göre ayrım sağlanır. Adsorpsiyon kromatografinin esasını, çözünmüş maddelerin katı yüzeyde soğrulma (adsorpsiyon) ve salınma olayları arasındaki fark oluşturur. Çözünen maddelerin birbirine karışmayan iki sıvı arasında dağılımı partisyon kromatografinin temelini oluşturur. İyon değişim kromatografi, yüklü yüzey moleküllerine sahip sabit faz ile bunun zıt yüküne sahip hareketli faz arasında iyonların yer değişimi esasına dayanır. Afinite kromotografisi analit ve bağlayıcı molekülün birbirine eşsiz bir biçimde bağlanması yöntemin esasını oluşturur.

Jel filtrasyonda moleküllerin büyüklüklerine göre ayrım sağlanır. Adsorpsiyon kromatografinin esasını, çözünmüş maddelerin katı yüzeyde soğrulma (adsorpsiyon) ve salınma olayları arasındaki fark oluşturur. Çözünen maddelerin birbirine karışmayan iki sıvı arasında dağılımı partisyon kromatografinin temelini oluşturur. İyon değişim kromatografi, yüklü yüzey moleküllerine sahip sabit faz ile bunun zıt yüküne sahip hareketli faz arasında iyonların yer değişimi esasına dayanır. Afinite kromotografisi analit ve bağlayıcı molekülün birbirine eşsiz bir biçimde bağlanması yöntemin esasını oluşturur.

Organizmada 5 ana protein sınıfı immünoglobinler olarak bilinir ve her grubun farklı kimyasal yapısı ve özel bir biyolojik rolü vardır. Immunglobulin G (IgG) en sık kullanılan immunokimyasal reaktif olup molekül ağırlığı 158000 Da olan bir glikoproteindir ve iki dupleks zincirden oluşmaktadır.

Molekül ağırlığı en az 4000-5000 Da olması gerekir.

Antijen- antikor bağlanmasını etkileyen kimyasal faktörler; iyonik türler, iyonik kuvvet ve polimerik moleküllerdir.