LABORATUVARLARDA KULLANILAN İLERİ ANALİZ YÖNTEMLERİ

Elektroforez, çeşitlilik arz eden ve iyonize olabilen analitlerin ayırımına yönelik çok yönlü ve güçlü analitik tekniktir. Yük taşıyan çözünmüş maddeler veya parçacıkların sıvı ortamda elektriksel alanın etkisiyle göç etmesi elektroforez tekniğinin kapsamını oluşturur.

İyonoforez, sadece küçük iyonların göç etmesini tarif eder.

Zon elektroforez kapsamında ise daha çok klinik uygulamalar yer almaktadır. Bu teknikte tamponla karışım halinde olan örnekler agaroz jel katman gibi gözenekli bir ortama uygulandıktan sonra yük taşıyan moleküller farklı alanlar şeklinde hareket eder.  Elektroforegram denilen ve destek materyali üzerinde komşularından kesin sınır ile ayrılan protein bölgeleri meydana getirir. Destek materyali proteine özgü boyalar ile muamele edildiğinde protein bölgeleri görünür hale gelir. Destek ortamı kurutulduktan sonra alanlarda yer alan proteinlerin miktarı dansitometre ile belirlenebilir. Elde edilen sonuçlar destek ortamının tamamen kurutulmasıyla kalıcı olarak saklanabilir.

İyonize olarak yüklenen kimyasal moleküller; taşıdıkları yüke göre elektroforez sisteminde ya anoda (artı elektrod) ya da katoda (eksi elektrod) göç ederler. Artı iyonlar (katyon) katoda, negatif iyonlar ise (anyon) anoda göç ederler. Artı ya da eksi yük taşıyabilen moleküller amfolit olarak anılır ve kendi izoelektrik noktalarından (pI) daha asidik ortamda bulunanlar artı yük alarak (proton bağlayarak) katoda göç ederler. Daha alkali ortamda ise eksi yüklenerek (proton vererek) anoda göç ederler. Proteinler iyonize olabilen amino (NH₂) ve karboksil (COOH) gibi grupları fazla sayıda taşıdıklarından çözeltilerde amfolit gibi davranırlar.

Göç etme hızı; molekülün net yükü, molekülün büyüklüğü ve şekli, elektriksel alan şiddeti, destek materyalinin özelliği ve çalışma ısısı gibi faktörlerden etkilenir. Elektroforetik hareket (µ) her bir birim alan şiddeti (volt/cm) başına göç hızı (cm/s) olarak tanımlanır.

İşlemde kullanılan tamponu içeren alanda platin veya karbondan imal edilmiş elektrot bulunur. Pozitif veya negatif kutbun yükü, güç kaynağına bağlanma şekline göre belirlenir. Ayırımın gerçekleştiği ortam olan elektroforez desteği ya tampon ile doğrudan ya da fitiller ile dolaylı olarak temas eder. Cihaz, güç kaynağına doğrudan bağlı olduğu için personel ve sistemin korunması ve yüzeyden buharlaşmanın en aza indirilmesi amacıyla, uygun kapaklar kullanılarak kapatılır.

Elektroforetik işlemde tampon çözeltilerin birden fazla görevi bulunmaktadır. Bunlar; akımı iletmek, elektroforezin gerçekleştirildiği pH yı oluşturmak, çözünen analitin yükünü belirlemek olarak sıralanabilir.

Elektroforezde kullanılan destek ortamlarının bazıları suyla temas ettiğinde hidroksil iyonlarını adsorbe ederek negatif yüklenir. İyonlar yüzeye bağlanarak hareketsiz kalır. Çözeltide var olan pozitif iyonlar bu eksi yüklü sabit bölgeler etrafında kümelenerek bulut meydana getirirler. Bulutla ilişki halinde bulunan negatif iyon miktarı sabitlenmiş halde bulunan negatif iyonlardan uzaklaştıkça artar ve sonunda her iki iyon konsantrasyonu eşitlenerek dengeye ulaşır. Sisteme akım uygulandığında destek ortamına bağlı olan iyonlar sabit kalır fakat diğerleri kendilerinin aksi kutbuna serbestçe hareket etmeye başlarlar. İyonlar yüksek oranda hidratize olduğundan kendilerinin hareketi içinde yer aldıkları çözücününde hareket etmesine neden olur. Bu fenomen endozmoz olarak tanımlanır ve bu olay sonucunda su tek yönde hareket eder.

Kağıt Elektroforezi

Nişasta Jel ve Selüloz Asetat Elektroforez

Agaroz Jel Elektroforezi

Poliakrilamid Jel Elektroforezi

Kromatografi, birbiri ile yakın benzerliği ve ilişkileri olan analitlerin, ayrımı ve miktarlarının belirlenmesine yönelik kullanılmaktadır. Çözünmüş haldeki maddelerin, hareketli faz ve sabit faz arasında farklılık gösteren dağılımlarına göre ayrılmasını kromatografik sistemler sağlar. Bu işlem sırasında hareketli faz aracılığıyla örnek, sabit fazı barındıran katman veya kolondan geçer. Mobil faz sabit faz üzerinden ilerledikçe, çözünen maddeler ya sabit faza tutunur ve hareket etmeyebilir veya sabit faza hiç tutunmadan mobil fazla beraber hareket edebilir. Diğer bir seçenekte ise örnek her iki faz ile birden etkileşir ve iki faz arasında dağılım gösterir. Sabit faza ilgisi daha çok olan analitler daha yavaş göç ederken, az olanlar daha hızlı hareket ederler. Analitlerin mobil faza ilgisi arttıkça göç etme hızı artar. Kuvvetli bağlanan analitler, sabit fazdan ancak mobil fazın kimyasal özelliği değiştirilerek ayrılabilirler.

Düzlemsel kromatografide sabit faz bir kağıt yaprağa (kağıt kromatografi) veya katı yüzeye tutturulur (ince tabaka kromatografi). Kağıt kromatografide sabit faz suyun veya polar bir çözücünün kağıdın lişerine tutturulması sonucu oluşturulur. İnce tabaka kromatografide silika jel gibi partiküllerin ince tabaka halinde cam levha, plastik ya da aluminyum katmanlar üzerine düzgünce yayılarak kaplanması ile oluşturulur. İnce tabaka küçük çaplı partiküllerden şekillendiği durumlarda tekniğe yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi denilmektedir.

Kolon kromatografide, sabit faz saf silika veya polimer olabilir. Destek ortamına ya kaplanmakta ya da kimyasal şekilde bağlanmaktadır. Sabit faz tüp içine doldurulabilir veya tüp iç yüzeyine kaplanabilir. Hareketli fazın gaz ya da sıvı olmasına göre kolon kromatografi gaz veya sıvı kromatografi olarak adlandırılır. Her iki teknik kütle spektrometresi ile beraber kullanılırsa buna birleştirilmiş teknikler denir ve gaz kromatografisi-kütle spektrometresi veya sıvı kromatografi-kütle spektrometresi tanımlarından bahsedilir. Hareketli faz, sabit faz içerisinden geçer. Bu sırada analitin kolondaki sabit fazla etkileşimleri sonucu, molekül özelliklerine göre bir sıralanma oluşur.

Analitik gaz kromatografi veya sıvı kromatografide hareketli faz kolondan çıkar ve dedektörden geçerek; zamanın, mesafenin veya hacmin fonksiyonunda elektronik sinyal oluşturur. Elde edilen grafik kromatogram olarak adlandırılır.

Kromatografik ayırımın sınıflandırılması, çözünen maddelerin fiziksel veya kimyasal özelliklerine göre yapılmaktadır. Bunlar iyon değişim, bölümleme (partisyon), soğurma (adsorbsiyon), boyut dışlama (jel filtrasyon) ve affinite kromatografileridir. Klinik laboratuvar uygulamalarında en çok iyon değişim ve partisyon kromatografi teknikleri kullanılmaktadır.

İyon değişim kromatografi, yüklü yüzey moleküllerine sahip sabit faz ile bunun zıt yüküne sahip hareketli faz arasında iyonların yer değişimi esasına dayanır. Şartlara bağlı olarak çözünmüş maddeler ya katyon (artı yüklü) ya da anyon (eksi yüklü) olarak bulunurlar. Ayırım, taşınan yüklerin fark ve miktarına dayanır. İşlemsel olarak sabit faz olarak görev yapan silika parçacıkları veya reçinenin yüzeylerine, anyonik veya katyonik yükleri sağlayan fonksiyonel gruplar bağlanır. Elektrokimyasal nötrlüğü sağlamak için ters iyon (counter ion) olarak tanımlanan takas iyonu, sabit yüklere çok yakın konumda bulunur ve hareketli fazda yer alan çözünmüş iyonlar ters iyonlar ile yer değiştirirler.

Çözünen maddelerin birbirine karışmayan iki sıvı arasında dağılımı partisyon kromatografinin temelini oluşturur. İşlemsel olarak sıvılardan bir tanesi sabit fazı oluşturur. Bu fazın oluşturulması için ince tabaka sıvı destek materyali üzerine veya kapiller kolonun iç yüzüne adsorbe edilir. Ayırım çözünen maddelerin sabit ve hareketli faz arasında göreceli çözünme yeteneğine bağlı olarak şekillenir.

Adsorpsiyon kromatografinin esasını, çözünmüş maddelerin katı yüzeyde soğrulma (adsorpsiyon) ve salınma olayları arasındaki fark oluşturur. Elektrostatik hidrojen bağları ve dağılımsal etkileşimler bu tip kromatografiyi kontrol altında tutan faktörlerdir. Bu çalışma şekli ile gaz kromatografi kullanılarak düşük molekül ağırlık ve oda ısında gaz formunda olan moleküller birbirinden ayrılabilmektedir.

Bu kromatografi çeşidi aynı zamanda jel filtrasyon, moleküler eleme, sterik eleme ve jel nüfuz kromatografisi olarak da bilinmekte olup moleküllerin büyüklüklerine göre ayrımını sağlar. Molekülün şekli ve hidratize formda bulunması işlemin sonuçlarını etkilemektedir. 

Affinite kromatografide analit ve bağlayıcı molekülün biribiri ile eşsiz bir biçimde bağlanması yöntemin esasını oluşturur. Enzim-substrat, hormon-reseptör veya antijen antikor etkileşimleri bu teknikte kullanılmaktadır.

İmmunokimyasal reaksiyonlar, immunoassay olarak bilinen hassas ve özgül testlerin esasını oluşturmaktadır. Tipik bir immunoassayda analiti yani antijeni tanımak üzere, antikorlar ayıraç olarak kullanılmaktadır. Spesifik antijenlere karşı hazırlanmış yüksek özgüllük ve affinitedeki antikorların varlığı ve antikorların eşsiz bir biçimde antijenleri çapraz bağlama yeteneklerinin oluşu spesifik maddelerin identifikasyonunu ve miktarlarının belirlenmesini sağlamıştır.

Organizmada antijenle uyarı sonrası plazma hücreleri tarafından üretilen ve yapısı sayesinde onlar ile özgün olarak reaksiyona girme kapasitesine sahip proteinlere antikor adı verilmektedir.

Imunojenite için gerekli özellikler aşağıda sıralanmıştır.

1. Molekül içinde kararlı yapıların var olması
2. Yapının rastlantısallığı
3. Molekül ağırlığının en az 4000-5000 Da olması
4. Metabolize olabilme yeteneği
5. Immunojenik konfigurasyonun antikor oluşturan mekanizmalara erişebilirliği
6. Yapısal olarak yabancılığı

Antijen-antikor bağlanması için birkaç farklı kuvvet birlikte hareket eder. Bu olaya katkıda bulunan bağlanma kuvvetleri; elektrostatik van der Waals-London dipol dipol etkileşimleri, hidrofobik etkileşimler ve iyonik kolombik bağlanmadır.

Kalitatif amaçlı kullanılan başlıca immunokimyasal yöntemler pasif jel difüzyon, immunelektroforez ve Western blottur.

Enzimle işaretli antijen ya da antikorun serbest antijen ya da antikor ile reaksiyona girmesi ve oluşan antijen antikor kompleksinin enzim aktivitesinin enzime spesifik substrat varlığında ortaya konması esasına dayanan ölçüm tekniğidir.

ELISA çeşitleri iki grupta incelenebilmektedir.

1. Yarışmalı teknikler

a) Antijen-enzim konjugatını kullanan teknik

b) Antikor-enzim konjugatını kullanan teknik

2. Yarışmalı olmayan teknikler

a) Çift antikor sandviç tekniği

b) Modifiye çift antikor sandviç tekniği

c) İndirekt teknik

Radyoligand yöntemlere örnek vermek gerekirse;

1. Radyoimmun yöntem (RIA)
2. Immunoradimetrik yöntem (IRMA)
3. Yarışmamalı (kompetetif) protein bağlama (CPB) yöntemi
4. Radyoreseptör analizi
5. Radyoenzimatik yöntem

başlıcalarıdır.

DNA polimeraz tarafından DNA sentezlenmesi için kullanılan yol göstericiye primer denilir ve bu ortalama 20 bazdan oluşan sentetik DNA dizisidir. DNA polimeraz enzimi primerin serbest kalan 3-OH ucuna baz eşleşme kuralına uygun olarak nükleotidleri ilave eder.