VETERİNER LABORATUVAR TEKNİKLERİ VE PRENSİPLERİ - Deneme Sınavı - 19

Bir ölçüm işleminin, bir sistemin, bir cihazın, bir metodun, bir yazılımın; belirlenen koşullara ve amaçlara uygunluğunun objektif olarak test edilerek yazılı delillerle onaylanması için yapılan işlemlere validasyon denir

Uluslararası birim sistemi (SI) ne göre "elektriksel direnç" fiziksel büyüklüğünün birimi "ohm" dur.

Distilasyon ile elde edilen damıtık su, distile su adını alır. Suyun distilasyonu uçucu olmayan organik, inorganik kirlilikleri ve mikroboyolojik organizmaları uzaklaştırır. Amonyak (NH3), CO2, Cl ve kaynama noktası düşük inorganik maddeler (Na, K, Mn, karbonat ve sülfat) distile edilmiş suda vardır. Sadece distilasyon işleminden geçirilen bir su örneği Tip I suyun gereklerini karşılamaz. Tip 2 veya Tip 3 suyun özelliklerini taşır.

Agaroz jel elektroforezi özellikle serum proteinlerinin, hemoglobin alt gruplarının, laktat dehidrogenaz izoenzimlerinin, lipoprotein fraksiyonlarının ve diğer maddelerin analizinde kullanılır. Agaroz jel, rutin analizlerde kullanılabilirlik ve çok yönlülük yönünden selüloz asetata eşdeğer kabul edilmektedir. Agaroz gözenek büyüklüğünün fazla oluşu ve proteinlerin buralardan sekteye uğramaksızın geçmesi ayırımı tamamen yükün kütleye oranına dayandırmaktadır. Agaroz jelin en önemli avantajı, proteinlere karşı affinitesinin düşük olması ve kuruduktan sonra gösterdiği doğal berraklığıdır. İyonize olan gruplardan temel olarak yoksundur ve hafif endozmotik karakter gösterir.

Agaroz jel elektroforezi özellikle serum proteinlerinin, hemoglobin alt gruplarının, laktat dehidrogenaz izoenzimlerinin, lipoprotein fraksiyonlarının ve diğer maddelerin analizinde kullanılır. Agaroz jel, rutin analizlerde kullanılabilirlik ve çok yönlülük yönünden selüloz asetata eşdeğer kabul edilmektedir. Agaroz gözenek büyüklüğünün fazla oluşu ve proteinlerin buralardan sekteye uğramaksızın geçmesi ayırımı tamamen yükün kütleye oranına dayandırmaktadır. Agaroz jelin en önemli avantajı, proteinlere karşı affinitesinin düşük olması ve kuruduktan sonra gösterdiği doğal berraklığıdır. İyonize olan gruplardan temel olarak yoksundur ve hafif endozmotik karakter gösterir.

Kağıt Elektroforezi Geçmişte serum proteinlerini ayırmada destek ortamı olarak yoğun olarak kullanılıştır. Günümüzde bu destek materyalinin yerini selüloz asetat veya agaroz jel almıştır. Kağıt elektroforezde ayırım süresi uzundur (14-16 saat) ve oldukça fazla artalan etkilşimi görülür. Bu olumsuz faktörlere rağmen, geçmşte yoğun kullanılmasının nedeni, destek ortamı olarak kolay elde edilebilirliği ve gerilme direncinin yüksek oluşudur.

Kromatografik ayırımın sınıflandırılması , çözünen maddelerin fiziksel veya kimyasal özelliklerine göre yapılmaktadır. Bunlar iyon değişim, bölümleme (partisyon), soğurma (adsorbsiyon), boyut dışlama (jel filtrasyon) ve affinite kromatografileridir. Klinik laboratuvar uygulamalarında en çok iyon değişim ve partisyon kromatografi teknikleri kullanılmaktadır.

İyon Değişim Kromatografi, yüklü yüzey moleküllerine sahip sabit faz ile bunun zıt yüküne sahip hareketli faz arasında iyonların yer değişimi esasına dayanır. Şartlara bağlı olarak çözünmüş maddeler ya katyon (artı yüklü) ya da anyon (eksi yüklü) olarak bulunurlar. Ayırım, taşınan yüklerin fark ve miktarına dayanır. İşlemsel olarak sabit faz olarak görev yapan silika parçacıkları veya reçinenin yüzeylerine, anyonik veya katyonik yükleri sağlayan fonksiyonel gruplar bağlanır. Elektro-kimyasal nötrlüğü sağlamak için ters iyon (counter ion) olarak tanımlanan takas iyonu, sabit yüklere çok yakın konumda bulunur ve hareketli fazda yer alan çözünmüş iyonlar ters iyonlar ile yer değiştirirler.

Partisyon Kromatografi:Çözünen maddelerin birbirine karışmayan iki sıvı arasında dağılımı partisyon kromatografinin temelini oluşturur. İşlemsel olarak sıvılardan bir tanesi sabit fazı oluşturur. Bu fazın oluşturulması için ince tabaka sıvı destek materyali üzerine veya kapiller kolonun iç yüzüne adsorbe edilir. Ayırım çözünen maddelerin sabit ve hareketli faz arasında göreceli çözünme yeteneğine bağlı olarak şekillenir.

Boyut Dışlama Kromatografisi (Jel Filtrasyon): Bu kromatografi çeşidi aynı zamanda jel filtrasyon, moleküler eleme, sterik eleme ve jel nüfuz kromatografisi olarak da bilinmekte olup moleküllerin büyüklüklerine göre ayrımını sağlar. Molekülün şekli ve hidratize formda bulunması işlemin sonuçlarını etkilemektedir. Sabit faz olarak çok çeşitli materyaller kullanılabilmektedir. Bunlar çapraz bağlı dekstran, poliakrilamid, agaroz, polystrene-divinilbenzen gözenekli cam veya bunların farklı kombinasyonlarıdır. Bu materyallerin tanecikleri gözeneklidir ve küçük moleküller gözeneklerde geçici olarak yakalanır. Gözeneklere giremeyecek kadar büyük olan moleküller ise tutulmadan mobil faz ile beraber kolonu terk eder. Orta boydaki moleküller gözeneklerin bir kısmında geçiçi süre ile tutulurlar ve kolonu büyüklerden sonra, fakat küçük moleküllerden önce terkederler. Bu tip kromatografi analitik olmaktan çok örnek hazırlamaya yöneliktir.

Immunelektroforez Proteinlerin elektroforez tekniği ile ayırımını takiben antikorlar ile reaksiyona girmesine dayanan biyokimyasal yöntemlere genel olarak immunelektroforez denilmektedir.

ELISA çeşitleri iki grupta incelenebilmektedir.

1. Yarışmalı teknikler

a) Antijen-enzim konjugatını kullanan teknik

b) Antikor-enzim konjugatını kullanan teknik

2. Yarışmalı olmayan teknikler

a) Çift antikor sandviç tekniği

b) Modifiye çift antikor sandviç tekniği

c) İndirekt teknik

Çift Antikor Sandviç Tekniği:

Teknikte iki antikor kullanılmaktadır ve ikinci antikor enzimle işaretlenmiştir.

İlk antikor ile katı faz kaplanmaktadır.

Örnek ilavesinden sonra antijen antikor kompleksi oluşması sağlanır ve ardından işaretli antikor ilave edilir.

En son substrat ilave edilerek renk oluşumu gerçekleştirilir.

Oluşan rengin şiddeti test antijeninin konsantrasyonu ile orantılıdır.

Aritmetik ortalama (Xort ) elde edilen değerlerin veri sayısına bölünmesiyle elde edilen değerdir.

Varyasyon katsayısı (CV) standart sapmanın aritmetik ortalamaya oranıdır.

Presizyon (Tekrarlanabilirlik): Aynı örneğin tekrar edilen ölçümlerinde benzer sonuçlar elde edilmesidir. Rastgele hatayı ölçmek için kullanılır.

Deteksiyon Limiti (Minimum Ölçüm Sınırı): Analizi yapılan maddenin en düşük konsantrasyonunu saptama ve sıfır değerinden ayırabilme sınırı olarak tanımlanmaktadır. İdeal bir yöntem yüksek düzeyde analitik duyarlılığa ve düşük düzeyde tayin sınırına sahip olmalıdır.

Kontrol materyalleri çalışırken dikkat edilmesi gereken noktalar özetle şu şekildedir:

• İçerdikleri analit konsantrasyonu bilinmektedir (Ortalama analit konsantrasyonu ve kabul edilebilir aralıklar üretici firma tarafından belirlenmiştir).
• Çalışılacak kontrol materyalinin lot numarası mutlaka kontrol edilmelidir. Lot numarası ile birlikte içerdiği analit konsantrasyonu değişiklik gösterebilmektedir.
• Dayanıklılık süresi (stabilitesi) önemlidir. Dayanıklılık süresinin uzun olması tercih edilir. Liyofilize kontroller sıvı olanlara göre daha uzun ömürlüdür. Ancak bu liyofilize materyallerin sulandırılmasına hataya yol açmamak için dikkat edilmelidir.
• Kontrol materyali saklama koşullarına dikkat edilmelidir. Kontrol materyalinin küçük hacimlerde olması bu açıdan kolaylık sağlar. Eğer büyük hacimde ise sulandırıldıktan sonra küçük hacimlere bölünerek saklanabilir.
• Çalışma öncesi analiz edilecek örneklerle aynı koşullarda çalışılır.
• Kalibratör yerine kullanılamazlar.
• Ticari kontrol çözeltileri kullanılabileceği gibi laboratuvar kendi kontrol çözeltilerini de hazırlayabilir. Laboratuvar kendi kontrol çözeltisini hazırladığında içerdiği ortalama analit konsantrasyonunu kendisi belirlemelidir.

Kontrol materyalleri çalışırken dikkat edilmesi gereken noktalar özetle şu şekildedir:

• İçerdikleri analit konsantrasyonu bilinmektedir (Ortalama analit konsantrasyonu ve kabul edilebilir aralıklar üretici firma tarafından belirlenmiştir).
• Çalışılacak kontrol materyalinin lot numarası mutlaka kontrol edilmelidir. Lot numarası ile birlikte içerdiği analit konsantrasyonu değişiklik gösterebilmektedir.
• Dayanıklılık süresi (stabilitesi) önemlidir. Dayanıklılık süresinin uzun olması tercih edilir. Liyofilize kontroller sıvı olanlara göre daha uzun ömürlüdür. Ancak bu liyofilize materyallerin sulandırılmasına hataya yol açmamak için dikkat edilmelidir.
• Kontrol materyali saklama koşullarına dikkat edilmelidir. Kontrol materyalinin küçük hacimlerde olması bu açıdan kolaylık sağlar. Eğer büyük hacimde ise sulandırıldıktan sonra küçük hacimlere bölünerek saklanabilir.
• Çalışma öncesi analiz edilecek örneklerle aynı koşullarda çalışılır.
• Kalibratör yerine kullanılamazlar.
• Ticari kontrol çözeltileri kullanılabileceği gibi laboratuvar kendi kontrol çözeltilerini de hazırlayabilir. Laboratuvar kendi kontrol çözeltisini hazırladığında içerdiği ortalama analit konsantrasyonunu kendisi belirlemelidir.

Levey-Jennings Kontrol Grafikleri:

1950’li yıllarda klinik laboratuvarlarda Levey ve Jenning tarafından tanıtıldığı için kontrol grafikleri Levey-Jennings kontrol grafikleri olarak adlandırılırlar. Bu grafikler kalite kontrol sonuçlarını daha kolay bir şekilde kontrol etmemizi sağlar. Her analit için konsantrasyonu bilinen kontrol çözeltilerinden elde edilen sonuçlar bu grafiğe işlenir. Elde edilen kontrol ölçümleri bu grafik üzerine yerleştirilir ve değerlendirme yapılır. Otomasyon ve laboratuvar informasyon sistemlerinin (LIS) gelişmesi ile birlikte kontrol sonuçları cihaz üzerinden veya ara bağlantı ile LIS üzerinden kolaylıkla görülüp değerlendirilebilir. Ölçülen her analit için günlük kalite sonuçları değerlendirilebildiği gibi son 1-2 aydaki sonuçlar da değerlendirilebilir.