TİBBİ CİHAZ VE MALZEMELER

Denatürasyon Evresi: Çoğaltılması istenen DNA molekülü, 95 C’de 30 sn. ya da 97 C’de 15 sn. tutularak denatüre edilip tek dal hâline getirilir. Doğru cevap A seçeneğidir.

İç içe (Nested) PCR özgün olmayan ürünlerin oluşumunu engellemek ve PCR tekniğinin spesifikliğini arttırmak için kullanılan bir PCR yöntemidir.
Bu PCR metodunda iki farklı set primer çifti kullanılarak iki PCR işlemi yapılır. İlk
PCR işleminde iki adet dış primerler kullanılır ve hedef molekül üzerinde uzun bir bölgenin amplifikasyonu yapılır. İkinci PCR işleminde ilk PCR sonucunda elde edilen DNA dizisi üzerinde iç primerler kullanılarak yeniden çoğaltma işlemi yapılır. İç primerlerin çoğalttığı DNA parçası, dış primerlerin çoğalttığı DNA parçasının içerisinde yer alır ve istenilen hedef bölge çoğaltılarak özgün ürünler elde edilir. Doğru cevap E seçeneğidir.

Eş zamanlı PCR sistemi klasik PCR kullanımına göre pek çok avantaj ve dezavantaja sahiptir. Bunlar:

Avantajları:
• Yöntemin en önemli avantajları arasında hassas, verimli, hızlı ve kontaminasyon
riskinin düşük olması sayılabilir.
• Klasik PCR belirli sayıda çevrimden sonra ölçüme izin verirken eş zamanlı PCR
veriyi eksponansiyel büyüme fazında elde eder.
• Raportör floresan sinyalindeki artış doğrudan üretilen PCR ürün miktarıyla
orantılıdır.
• Hedef sekansı tespit eden dinamik aralık oldukça geniştir.
• PCR sonrası ek işlemlere ihtiyaç duymaz.
• Duyarlılık başlangıç materyalindeki sadece 2 katlık bir değişime kadar düşürülebilmektedir.

Dezavantajları:

• Amplikon boyutu sistem açılmaksızın takip edilememektedir.
• Mevcut sistemler multipleks yetkinliğini sınırlandırmaktadır.

• Bazı sistemler florejenik kimyasallarla uyumsuzluk göstermektedir.
• Kullanılan teknoloji, kalite yetkinlik ve kontrol düzenlemeleriyle denetlenirse güvenli sonuçlar vermektedir.
• Standardize edilmiş analiz sistemleri ise her yeni uygulamada optimizasyona ve validasyona ihtiyaç duyar. Aksi hâlde eş zamanlı PCR sistemi oldukça fazla miktarda ancak doğru olmayan veri sunacaktır.

Doğru cevap D seçeneğidir.

Dizi spesifik floresan problar: Hedef diziye özgül ve floroforlarla işaretli problardır. Spesifik DNA dizisi mevcut ise reaksiyona katılırlar. Dizi spesifik problar hibridizasyon ve hidroliz problarını içerir.

FRET, 3’ ucu floresan işaretli bir verici probdan yakındaki 5’ ucu floresan
işaretli alıcı proba enerji transfer etme işlemidir.

Hidroliz probları (TaqMan): Taq polimerazın 5’ – 3’ nükleaz aktivitesinden yararlanan prob sistemidir. Mutasyon tayini, PCR amplifikasyonu sonrası iki alele özgül raportör boyanın sinyal yoğunluğunun ölçülmesiyle yapılır. Yöntemin esası, 5’ ve 3’ uçlarından florofor maddelerle işaretli prob kullanılmasına dayanır. Probun 5’ ucunda raportör florofor, 3’ ucunda ise baskılayıcı florofor bulunmaktadır. Prob – hedef DNA molekülü arasındaki hibridizasyon devam ettiği sürece raportör floroforun sinyal oluşturması, 3’ uçtaki baskılayıcı florofor tarafından engellenmektedir. Primerlerin hedef DNA’ya bağlanmasıyla başlayan primer uzaması, probun bağlandığı noktaya kadar geldiğinde, sentezin devam
edebilmesi için Taq DNA polimeraz enzimi 5’ – 3’ nükleaz aktivitesini kullanarak probu 5’ uçtan yıkmaya başlar. Böylece raportör florofor serbest hâle geçer ve sinyal oluşturur. Her döngüde meydana gelen PCR ürünü miktarına paralel olarak sinyal şiddeti de artar. Doğru cevap C seçeneğidir.

Pirodizileme yöntemi esasında bir eş zamanlı dizi analizi yöntemidir, zincir terminasyonu yöntemini baz alır. Bu yöntemde, dizi analizi primerinin uzaması süresince DNA polimeraz enzimi bir dNTP’nin birleşmesini sağlar. Klasik dizi analizinden farklı olarak herhangi bir elektroforez aşamasına, dNTP’lere, floresan işaretli nükleotidlere gerek yoktur. Bir adet dNTP birleştiği zaman, pirofosfat oluşumu, ışık emisyonu ile sonuçlanan lusiferazın katalizlediği bir reaksiyonla birleştirilir. Bu yöntem klasik dizi analizlerindeki gibi bir sekans dizisi oluşturmaz. Doğru cevap B seçeneğidir.

Moleküler İşaret Fenerleri (Molecular Beacons): TaqMan probunun geliştirilmiş
şekline moleküler işaret feneri (molecular beacons) adı verilmiştir. TaqMan probundaki oligonükleotidlerin orta kısmındaki spesifik bölgelere ek olarak, probun 5’ ve 3’ uçlarında komplementer sekanslar bulunur. Bu sekansların görevi probun uçlarının kıvrılarak saç tokası şeklini almasını sağlamaktır. Böylece quencer ve raportörün birbirine ışığın emisyonunu önleyecek kadar yakınlaşması garantilenir. Doğru cevap D seçeneğidir.

Pirodizileme reaksiyon basamakları şu şekildedir:
1. DNA segmenti amplifiye edilir ve dizi pirodizilemede kalıp olarak kullanılmak
üzere biyotinlenir. Denatürasyondan sonra biyotinlenmiş tek zincirli PCR amplikonu izole edilerek sekanslayıcı primer ile hibridize olması sağlanır.
2. Hibridize olmuş primer ve kalıp zincir, DNA polimeraz, ATP sülfürilaz, lusiferaz,
apiraz, adenozin 5’ fosfosülfat (APS) ve lusiferin ile inkübe edilir.
3. İlk deoksiribonükleotid trifosfat (dNTP) reaksiyona katılır. DNA polimeraz sekanslayıcı primere dNTP katılımını katalizler. Kalıp diziye her dNTP inkorporasyonu, katılım sayısıyla orantılı biçimde pirofosfat (PPi) salınımına
sebep olur.
4. ATP sülfürilaz PPi’yi APS’nin varlığında ATP’ye dönüştürür. Bu ATP,
lusiferinin oksilusiferine dönüşümünü tetikleyerek ortaya çıkan ATP oranına
bağlı görünür dalga boyunda ışık üretir. Lusiferaz ile üretilen ışık sensörler
tarafından tespit edilir ve bilgisayar programında pik olarak değerlendirilir. Her bir pikin (ışık sinyalinin) yüksekliği inkorpore olan nükleotid sayısıyla orantılıdır.
5. Apiraz ortamda bulunan inkorpore olmamış nükleotidleri ve ATP’yi
parçalar. Parçalanma tamamlandığında diğer bir nükleotid ilave edilir.
dNTP’lerin ilavesi seri hâlinde devam ettirilir. Proses devam ettikçe, komplementer DNA dizisi uzar ve nükleotid dizisi program aracılığıyla sinyal piklerinden belirlenir.

Doğru cevap C seçeneğidir.

Pirodizileme sisteminin diğer dizi analizi yöntemlerine göre avantaj ve dezavantajları şöyle özetlenebilir:
Avantajları:
• Metod çok örnekli işlemler için kolaylıkla adapte edilebilir.
• Geleneksel metodlarla kıyaslandığında maliyet daha efektiftir.
• Sekanslama reaksiyonları oda sıcaklığında ve fizyolojik pH’ta gerçekleşir.
• Sinyal yakalanması yaklaşık 2 dakikalık çevrimlerledir.
• Etiketlenmiş primerlere, nükleotidlere ve jel elektroforezine olan ihtiyacı kaldırır.
• Kısa zincirler oldukça verimli sekanslanabilir: Sinyal-gürültü oranı 40 çevrimden sonra bile oldukça yüksek kalabilmektedir.
• Düşük frekanslarda bulunsa bile allel kantifikasyonu yapılabilir.
• Bilinmeyen sekans varyantlarını tespit edebilir.
Dezavantajları:
• Katı faz uygulamasındaki her nükleotid ilavesinde yapılan yıkama materyal kaybına sebep olduğu için sinyal kalitesini düşürür.
• Sıvı faz uygulamasındaki apirazın etkinliği ilerleyen döngülerde ara maddelerin
birikmesi sebebiyle azalır.
• Sıvı faz uygulamasındaki apiraz ve DNA arasında spesifk olmayan etkileşim gözlenir ve bu durum nükleotid degrede edici aktivitenin kaybına yol açar.
• Homopolimerik bölgelerde 5’ten daha fazla aynı ardı sıralı nükleotidinin korporasyonunu takiben oluşan salınım lineer olmamasından dolayı diziye katılan nükleotidlerin doğru sayısının tespiti zorlaşır.
• PPi ile gerçekleşecek kontaminasyon sinyal-gürültü oranını önemli ölçüde düşürür. Tamamlanmamış nükleotid inkorporasyonları da arka plan sinyalini önemli ölçüde arttırır.
• Ekzonükleaz içermeyen DNA polimerazın kullanımından dolayı nükleotid inkorporasyon güvenirliği yeterince yüksek değildir.
• Uzun sekanslar için kalıp materyalin ve baz/maliyet oranının stabilitesi iyileştirilmelidir.
• Yanlış primer bağlanması fragmentasyona ya da enzimatik parçalanmaya yol
açarak reaksiyon karışımındaki kalıp DNA’nın harcanmasına ve böylelikle sinyal
kaybına yol açabilir. Doğru cevap D seçeneğidir.

DNA heliksinde bazlar heliksin iç kısmında, fosfat ve şeker omurgası ise dış kısmında yer alır.

2

Albumin

Primerlerin bağlanması için ortam ısısı 40-60 dereceye düşürülür.

Çoklu (multipleks) PCR, aynı DNA kalıbı kullanılarak çok sayıda gen veya ürününün birden fazla primer seti kullanılarak çoğaltılması işlemidir.

Hidroliz probları (TaqMan): Taq polimerazın 5’ – 3’ nükleaz aktivitesinden yararlanan prob sistemidir

Elektroforez işlemi farklı boyutlardaki moleküllerin elektrik yüklü bir ortamda ayrılmaları ve analiz edilmeleri için kullanılan bir tekniktir.

DNA dizi analizi, moleküler genetikte mutasyonu tanımlamak ve tiplendirmek için geliştirilen önemli bir analitik tanı yöntemidir.

Pirodizileme yöntemi esasında bir eş zamanlı dizi analizi yöntemidir, zincir terminasyonu yöntemini baz alır.

Biyoinformatik ve moleküler genetik alanındaki ilerlemelere paralel olarak geliştirilen mikroarray teknolojisi tek bir çip üzerinde tüm genomun (DNA) ve ekspresyon ürünlerinin (RNA ve protein) incelenmesi yöntemidir.