TEMEL VETERİNER PATOLOJİ

Organizmada immün yanıt oluşturabilen ve bunun sonucunda kendilerine karşı özel antikor şekillendirebilen maddelere antijen veya immünojen denir. Genellikle bu maddeler protein, glikoprotein ya da lipoprotein yapısındadırlar.

İmmünolojik yanıtta T ve B lenfositler en önemli role sahip hücrelerdir. T lenfositler antijene karşı lenfokin salgılayarak doku düzeyinde; B lenfositler ise immünglobulin (Ig) adı verilen bir grup protein salgılayarak sistemik immün yanıt oluştururlar. Antijene karşı immün sistem tarafından oluşturulmuş olan Ig yapısındaki tüm bu maddelere antikor denir.

Birinci aşama (denatürasyon); DNA yapısını bozma (denatürasyon) aşamasıdır. Bu amaçla karışımı yüksek ısıda (94-97°C arasında 15-60 sn) ısıtılır ve çift sarmal ayrı ayrı tek zincir haline döner. DNA içeren bir çözeltide, yüksek sıcaklıkta bazlar arasındaki hidrojen bağları kopar ve çift sarmal “termal denatürasyon” açılır.

İkinci aşama (annealing); bağlanma dönemidir. Kalıp nükleik asit ipliklerinin eşleşerek çift iplikli molekül oluşturmasıdır. Denatürasyon sonrasında ortam ısısı (47-60°C arasında 30-60 sn) düşürülür ve düşük ısıda primerler, tek zincirli DNA üzerinde kendi ile eşleşen sekanslarla bağlanırlar.

Üçüncü aşama; uzama dönemidir. DNA polimeraz enzimi etkisiyle (72°C’de, 30 sn ile 3 dakika), tamamlayıcı DNA zincirinin uzatılması işlemidir.

İn vitro nükleik asit amplifikasyonu için başlangıç materyali olarak kullanılan, mRNA ve viral RNA gibi RNA hedef dizilerinden, yararlanılan modifiye (kısmen değiştirilmiş) PCR yöntemidir. 1970’lerde retroviral reverse transcriptase’ın bulunması bu yöntemin yapılabilirliğini sağlamıştır. Bu yöntemde reverse transkriptase enzimi aracılığıyla izole edilmiş mRNA, tamamlayıcı DNA (cDNA) molekülüne çevrilmektedir. Elde edilen cDNA, PCR amplifikasyonu için kullanılır. Ayrı ayrı iki aşama halinde uygulanan RT-PCR daha hassas; tek aşamalı ise daha az bulaşma riski taşır.

Real time PCR, klasik PCR esasına dayalıdır, ancak reaksiyon devam ederken gerçek zamanda PCR ürünü saptanır ve ölçülür. Tüm PCR bileşenlerinin yanı sıra PCR amplikonlarını görmek için floresansla işaretli moleküllerden yararlanılır. PCR süresince, amplifikasyon sonrası açığa çıkan PCR ürünlerinin miktarı ile orantılı olarak artan floresans ışıldamasının şiddetinin ölçümüne dayanır.

Multiple PCR, farklı hedef DNA sekanslarına özgü çok sayıda primer çifti kullanarak gerçekleştirilen modifiye Real time PCR’dır. Bu yöntemde kısa sürede çok sayıda hedef bölge amplifikasyonu gerçekleştirilebilmektedir.

Farklı primerler kullanarak iki kez amplifikasyon işleminin uygulanmasından ibaret PCR yöntemidir. İlk amplifikasyonda elde edilen ürün, ikinci PCR için kalıp olarak kullanılır ve kullanılan ikinci primer takımı diziye özgüdür.

İn situ PCR yönteminde aranılan DNA veya mRNA’nın PCR’ın temel prensiplerinden hareketle doku veya hücre kültüründe hücre yapısının korunarak çoğaltılması ve oluşan ürünlerin görünülür bir hale getirilmesini kapsar. Parafinde bloklanmış dokular direkt bu yönteme uyarlanmıştır.

Ekzojen antijenler, herhangi bir şekilde vücuda dışarıdan alındığında immun yanıt sonucu, yalnız kendileri ile birleşebilen antikor oluşumuna sebep olan antijenlerdir. Mikroorganizmalar, çiçek polenleri ve bazı toksinler sıklıkla rastlanılan bu grup immunojenlerdir.

Diğer seçeneklerdeki antijenler, endojen antijenler olarak sınıflandırılmaktadır.

Organizmada immun yanıt oluşturabilen ve bunun sonucunda kendilerine karşı özel antikor şekillendirebilen maddelere antijen veya immunojen denir. Genellikle bu maddeler protein, glikoprotein ya da lipoprotein yapısındadırlar. Antijenler, antikorlara epitop veya antijenik belirleyici denilen bir bölgeden bağlanırlar ve her bir antijen sadece kendisiyle reaksiyona girebilecek antikorlar oluştururlar. Buna karşılık belli bir antijene karşı elde edilmiş antikorlar başka antijen(ler)le reaksiyona girebilir ki buna da çapraz reaksiyon denir. Antijenler, vücutta yapılmalarına ve dışarıdan alınmalarına göre iki grupta incelenirler.

IgG’ler vücutta en uzun kalan ve en fazla bulunan antikorlardır.

Monoklonal antikorlar bağlanma özelliği açısından tek bir epitopla bağlanırlar.

İdeal moleküler tespit solüsyonlarıyla ilgili olarak;

Değişikliklerden çabuk etkilenmemelidir.

Yüksek ısılarda aktif olmalıdır.

Ekonomik ve etkili olmalıdır.

Proteolitik özellikleri çok iyi bilinmelidir.

DNA, RNA ve proteinlerini korumalıdır.

PCR reaksiyonu üç aşamadan oluşur:

Birinci aşama (denaturasyon); DNA yapısını bozma (denaturasyon) aşamasıdır. Bu amaçla karışım yüksek ısıda (94-97°C arasında 15-60 sn) ısıtılır ve çift sarmal ayrı ayrı tek zincir haline döner. DNA içeren bir çözeltide, yüksek sıcaklıkta bazlar arasındaki hidrojen bağları kopar ve çift sarmal “termal denaturasyon” açılır.

İkinci aşama (annealing); bağlanma dönemidir. Kalıp nükleik asit ipliklerinin eşleşerek çift iplikli molekül oluşturmasıdır. Denatürasyon sonrasında ortam ısısı (47-60°C arasında 30-60 sn) düşürülür ve düşük ısıda primerler, tek zincirli DNA üzerinde kendi ile eşleşen sekanslarla bağlanırlar.

Üçüncü aşama; uzama dönemidir. DNA polimeraz enzimi etkisiyle (72°C’de, 30 sn ile 3 dakika), tamamlayıcı DNA zincirinin uzatılması işlemidir.

Doğru cevap A'dır.

Deoksinukleosid Trifosfat: Dört adet “deoksinucleoside triphosphate” olan dATP, dCTP, dGTP ve dTTP, amplikon polimerizasyonu için gerekli olan bileşenlerdir. Doğru cevap E'dir.

İn situ PCR yönteminde aranılan DNA veya mRNA’nın PCR’ın temel prensiplerinden hareketle doku veya hücre kültüründe hücre yapısının korunarak çoğaltılması ve oluşan ürünlerin görünülür bir hale getirilmesini kapsar. Parafinde bloklanmış dokular direkt bu yönteme uyarlanmıştır. Dokunun yapısının bozulmaması, aranılan nükleik asit sekansının in situ olarak çoğaltılması, ultrastruktürel boyutta da uygulanarak incelenmesi yönünden avantajlar taşır. Doğru cevap A'dır.

Real time PCR, klasik PCR esasına dayalıdır, ancak reaksiyon devam ederken gerçek zamanda PCR ürünü saptanır ve ölçülür. Tüm PCR bileşenlerinin yanı sıra PCR amplikonlarını görmek için floresansla işaretli moleküllerden yararlanılır. PCR süresince, amplifikasyon sonrası açığa çıkan PCR ürünlerinin miktarı ile orantılı olarak artan floresans ışıldamasının şiddetinin ölçümüne dayanır. Doğru cevap D'dir.

Magnezyum Klorür: PCR'de magnezyum klorür yoğunluğunun çok iyi ayarlanması gerekir. Çünkü bu primer bağlanmasını, denatürasyon için gerekli sıcaklığını, ürün spesifikliğini, primer-dimer oluşumunu ve enzim aktivitesini oldukça fazla etkilemektedir. Doğru cevap C'dir.