BOYAMA VE MİKROSKOPLAR

Dokuların kimyasal maddeler kullanılarak boyanmasına ilişkin ilk uygulamalar 18. yüzyıl sonlarında başlamış ve sonrasında çok çeşitli kimyasal boyama teknikleri geliştirilmiştir. Laboratuvarda çeşitli kimyasal maddeler kullanarak ve dokuda birtakım kimyasal reaksiyonlar oluşturulmasıyla doku ve elemanlarını ayırt etmeye yerleşim ve yayılımları ile miktarlarını tanımaya yarayan kimyasal yöntemlerin adı “histokimya” dır. Histokimya boya yöntemleri esasen son yüzyılın ikinci yarısında geliştirilmiş ve bir çoğu az-çok değiştirilerek günümüze kadar gelmiştir.

Ekstraksiyon: Özünü çıkarma, herhangi bir maddenin çeşitli yöntemlerle özünü elde etme işleminde denir.

Rekristalizasyon: Elde edilen özütün tekrar kristal haline dönüştürülmesine denir.

Mordant: Boya ile iyi bir birleşim oluşturarak boya doku bağlanmasını kolaylaştıran maddedir.

Zıt Boya: Dokuda boyanması gereken kısımların daha iyi görünmesi amacıyla, diğer yapıların farklı bir boya ile boyanmasıdır.

Konnektif ve kas dokusu boyaları:

• Masson’un Trikrom Boyası
• Van Gieson Boyası

Yağ ve karbonhidrat boyaları:

• Oil Red O Boyası
• Best’in Carmine (Glikojen) Boyası

Pigment ve mineral boyaları:

• Lillie’in Nil Mavisi Boyası
• Von Kossa Boyası

Mikroorganizmaların boyaları:

• Gram-Weigert Boyası
• Ziehl-Neelsen Boyası
• Gridley Mantar Boyası

Sinir dokusu elemanları boyaları:

• Holzer Boyası (Glia hücre ve iplikleri için)
• Luxol Fast Blue Boyası (Myelin iplikleri için)

Stereoloji: Mikroskoptaki iki boyutlu görüntülerden elde edilen sayısal verilerle (sayı, çap, hacim, yoğunluk, yüzey alanı) üç boyutlu yapı hakkında veri elde edilmesini sağlayan morfometrinin bir dalıdır.

Mikroskop çeşitleri:

• Işık Mikroskop
• Faz Kontrast Mikroskop
• Polarizasyon (kutuplaştırma) Mikroskobu
• Konfokal Mikroskop
• Floresans Mikroskop
• Elektron Mikroskop

Elektron mikroskop çeşitleri:

• Geçirimli elektron mikroskobu (TEM)
• Taramalı elektron mikroskobu (SEM)

Geçirimli elektron mikroskobu (TEM); yüksek çözümleme gücüne sahiptir. Bu çözümleme gücü görüntülenen yapının ayrıntılarını 400.000 kez büyüterek iki boyutlu görülebilmesini sağlar. TEM’unda elde edilen görüntüler daima siyah-beyazdır. Elektron mikroskobu fotoğrafının koyu alanları elektron yoğun, renkli alanlar ise elektron geçirgen olarak adlandırılır.

Taramalı elektron mikroskobu (SEM); hücrelerin, dokuların ve organların yüzeyine ait üç boyutlu görüntüler oluşturur. TEM’den farklı olarak elektronlar örneğin içinden geçmez. Elektronlar daha önceden işleme esnasında kaplanan ince metal (altın) tabaka üzerine çarpar ve saçılır. Bunlar yakalanarak yükselticilerle üç boyutlu olarak ekrana yansıtılır ve oluşan görüntüler siyah-beyazdır. SEM yalnızca organları n yüzeylerini gösterdiğinden çoğunlukla boşluklu (mide, bağırsak, akciğer) organların incelenmesinde kullanılırlar.

Belli floresans maddeler uygun dalga boyundaki ışık alttan tutulduğunda daha uzun dalga boyunda ışık yayarlar. Bu olaya floresans denir. Floresans mikroskopta doku örnekleri genelde ışık yelpazesinin görülebilir kısmında yeralacak şekilde morötesi ya da lazer ışığı altında tutulur. Floresans maddeler karanlık bir zemin üzerinde parlak ışıklı parçacıklar şeklinde izlenir. Veteriner patolojide özellikle kuduzun hızlı tanısında kullanılan bu mikroskoplarda FITC (floresansizotiyosiyanat) ile bağlanan antikorların antijenle oluşturduğu kompleks yeşilimsi-sarı parlak renkte görülür ve pozitif sonuç olarak değerlendirilir.

Konfokal terimi bir objenin ve görüntüsünün aynı odağa sahip olmasına denir. Floresans mikroskop esaslarına göre çalışan çoğunlukla floresans mikroskobun gelişmiş şekli olarak kabul edilir. Konfokal mikroskop floresansla işaretlenmiş, saptanmış ya da canlı hücrelerde yüksek çözünürlük sağlayarak görüntü elde etme ve elde edilen görüntüleri birleştirerek üç boyutlu yapısı hakkında fikir vermektedir. Anlaşılacağı üzere örnek floresan bir molekülle işaretlenmesi gerekir ki bu rutin kesitlerde çalışamaz anlamına gelmektedir. Diğer taraftan elde edilen görüntüleri birleştirerek üç boyutlu görüntüye dönüştürmesi bu mikroskobu bilgisayara bağımlı bir teknik haline getirmektedir.

Myelin: Mavi-yeşil. ; Mantar ve PAS pozitif elementler: Pembeden kırmızıya. ; Çekirdekler: Koyu mavi. ; Sitoplazmik nükleoproteinler: Mavimsi mor. ; Kapillarlar: Kırmızı.

Glia hücre ve iplikleri: Koyu menekşe. ; Zemin: Açık menekşe.

Gram-pozitif bakteri ve mantar: Mor. ; Gram-negatif organizmler: Genellikle boya almaz. Fibrin: Mavi-siyah.