TEMEL VETERİNER MİKROBİYOLOJİ VE İMMÜNOLOJİ

Koagulaz Testi
Test patojenik stafilokokların belirlenmesinde kullanılan enzimatik bir testtir.
Testte reaktif olarak taze hazırlanmış ya da ticari olarak dondurularak kurutulmuş
tavşan plazması kullanılır. Tavşan plazması bazı türler (patojenik) tarafından sentezlenen stafilokokal koagulaz enzimi tarafından fibrine dönüştürülen fibrinojeni
içerir.

İnkubasyon Atmosferi
Patojenik bakterilerin çoğu aerobik atmosferik koşullarda üremektedir.
Mikroaerofilik atmosferde (%5-10 CO2) üreyen mikroorganizmalara örnek
olarak Brusella türleri, Francisella tularensis, Hemofilus türleri, Taylorella equigenitalis gibi bakteriler verilebilir. Anaerobik atmosferde üreyen bakterilere ise
Klostridium türleri, Fusobakterium türleri, Bacteroides türleri ve Actinomyces bovis gibi mikroorganizmalar örnek verilebilir

Kapsül boyama

Rough karakterde

Küçük, yuvarlak ve üzerleri düzgün görünümdedir

Differensiyal besiyeri

Selektif besiyeri

Maya ekstraktı

Koagulaz Testi

Diğer ifadeler doğru olup C seçeneği yanlıştır. Etil alkol derşimi % 70’lik olmalıdır. Lezyonlu bölgelerden hazırlanan boyalı preparatların mikroskobik incelenmesiyle önemli bilgilere basit, hızlı ve ekonomik olarak ulaşılabilir. Mikroskobik inceleme yapılmadan önce mikroskop lamları temiz ve yumuşak bir bez ile silinmeli ve bek alevinden geçirilerek üzerindeki olası yağ tabakası uzaklaştırılmalıdır. Bunun dışında, lamlar sıvı temizleyici ile yıkanıp, durulanıp, kuru temiz bir bez ile kurulanarak da incelemeye hazır hale getirilebilir. Muayenede preparat hazırlanmasında kullanılacak olan küt uçlu bistüri ve pens %70’lik etil alkol içeren bir kap (çoğunlukla rahat çalışmaya imkan verdiği için cam beherler tercih edilmektedir) içerisinde bekletilir. Bistüri ve pens bek alevinde yakılır ve kullanım öncesi soğutulur. Kullanıldıktan sonra ise dezenfektan içeren başka bir kaba alınır. Bir doku lezyonundan preparat hazırlanırken materyal pens ile sıkıca tutulurken bistüri ile materyalin lezyonlu bölgesinin derin katmanlarından kazıntı örneği alınır. Bu doku kazıntıları temiz bir lam üzerine alınıp, başka bir lam bunları ezmek için kullanılarak ince bir preparat hazırlanır. Sıvı ya da visköz örneklerde steril bir svap kullanılarak örnekleme yapılır ve lam üzerine bu materyal ince bir tabaka oluşturacak şekilde yayılarak preparat hazırlanır. Preparatlar hazırlandıktan sonra daha sonraki işlemler öncesinde kurumaya bırakılır. Preparat fiksasyonunun amacı vejetatif bakterilerin öldürülmesi, onların boyaya geçirgen hale getirilmesi ve materyalim lama sıkıca sabitlenmesini sağlamaktır. Fikse edilmiş ve boyalı preparatlar bazı bakteriler özellikle de endosporlar inaktive edilmemiş olabileceğinden dikkatle incelenmelidir. İncelendikten sonra boyalı preparatlar otoklavlanmalı veya uzaklaştırılmadan önce güvenilir bir dezenfektan içerisinde 24-48 saat bekletilmelidir. Boyama öncesinde lam preparat hazırlanmış kısmı üstte kalacak şekilde bek alevinden (alevin mavi renkli kısmı üzerinden) 2-3 kez hızlı bir şekilde geçirilerek fikse edilir. Bu aşamada preparatın aşırı ısıtılıp yakılmamasına (lam elin tersini yakmayacak sıcaklıkta olmalıdır) dikkat edilmelidir. Giemsa boyama yönteminde kurutulmuş preparatlar öncelikle absolut metil alkol içerisinde 3 dakika boyunca fikse edilir (kimyasal fiksasyon) daha sonra kurutularak boyama işlemine geçilir.

Karbol fuksin ile boyama: Bu boyama yöntemi Campylobacter türleri, Serpulina hyodysenteriae ve Fusobacterium necrophorum gibi bakterilerin görüntülenmesinde kullanılır. Kurutulmuş ve fikse edilmiş preparatlar üzerine, karbol fuksin solüsyonu konur ve 5-10 saniye lam üzerinde bırakıldıktan sonra boya dökülür ve hafif akan su ile yıkanır. Kurutma kağıdı ile veya havada kurutulduktan sonra üzerine sedir yağı konarak immersiyon objektifi ile bakılır. Mikroorganizmalar kırmızı renkte görülürler.

Negatif boyama: Bu boyama yönteminde mikroorganizmalar yerine saha boyanır. Karanlık olan sahada mikroplar renksiz veya parlak olarak görülürler. Boya olarak nigrosin veya çin mürekkebi kullanılır. Lam üzerine bir damla boya ve sonra bir damla kültür koyarak yayılır ve ince bir froti hazırlanır. Kuruduktan sonra muayene edilir. Bu boyama yöntemi kapsül ve spiroketleri incelemek için kullanılır.

Bu yöntemle mavi renkli ya da mor görülen mikroorganizmalar Gram pozitif ve kırmızı veya pembe renkli mikroorganizmalar ise Gram negatif olarak değerlendirilirler. Bakterilerin Gram pozitif ya da Gram negatif boyanmaları Gram boyanma prensipleri ile açıklanabilir. Buna göre, Gram pozitif mikroorganizmalar, negatiflerden daha düşük pH limitlerine sahiptirler. Bu nedenle de bazik boyalara karşı affiniteleri fazladır. Gram pozitiflerden elde edilen lipoidal maddelerin özelliği Gram negatiflerinkinden farklıdır. İlkinde doymamış yağ asitleri daha fazladır ve aynı zamanda oksidan maddelere olan ilgileri de yüksektir. Kullanılan mordanların oksidan olması bazik boyalara karşı affiniteyi artırır. Gram pozitif bakterilerin hücre duvarı peptidoglikan yapısında olup miktarca çok fazladır. Bu yapısal özellik Gram negatiflerde ise çok azdır. Bu tabakanın giderilmesi, Gram pozitif mikropları Gram negatif hale sokar. Gram pozitiflerde aynı zamanda magnezyum ribonukleat da fazla miktarda bulunur. Bu madde negatiflerde yoktur. Alkolle dekolorasyonun gereğinden uzun süre yapılması Gram negatifliğe eğilimi artırır. Gram pozitiflerde hücre duvarında teikoik asit vardır.

Nazlı üreme özelliğinde olanlar da dahil birçok bakterinin üretilmesi Kanlı agar ile, Salmonella izolasyonunda kullanılan zenginleştirme brothu olarak Selenit buyyon, Salmonella ve bazı bakterilerin izolasyonu için XLD agar ve Brilliant green agar kullanılmaktadır.

MacConkey agar Enterobakteriler ve diğer bazı Gram negatif bakterilerin üretilmesinde, Salmonella identifikasyonunda TSI agar, Escherichia coli identifikasyonunda EMB agar, Hemofilus türleri için zenginleştirilmiş besiyeri için Çikolata agar ve Streptokoklar için selektif besiyeri Eskülin hidrolizi ve hemolizi ortaya koyan besiyeri ise Edwards besiyeridir.

Nazlı üreme özelliğinde olanlar da dahil birçok bakterinin üretilmesinde kanlı agar kullanılır. Nutrient agar temel besiyeri. Nazlı üreme özelliğinde olmayan bakterilerin üretilmesinde kullanılır. Enterobakteriler ve diğer bazı Gram negatif bakterilerin üretilmesinde MacConkey agar kullanılır. Escherichia coli identifikasyonunda EMB agar kullanılır. Hemofilus türleri için zenginleştirilmiş besiyeri için Çikolata agar kullanılır.

Serum: Sıvı veya katı ortamlara %5-10 oranında ilave edilir. Bileşiminde organik ve inorganik maddelerle üretme faktörleri de vardır. Güç üreyen mikroorganizmaların gelişimini kolaylaştırır. Sodyum klorür: Çoğu besiyerinin bileşimine izotonik bir ortam oluşturmak için katılır. Tuza dayanıklı (halotolerant) ve tuz seven (halofil) bakterilerin selektif izolasyonu için yüksek konsantrasyonlarda özel besiyerlerinin bileşimine katılır. Su: Su besiyerlerinin esasını teşkil eder. Besiyeri hazırlamada kullanılan suyun damıtma veya deiyonizasyon ile taze hazırlanmış olması, başta bakır olmak üzere toksik metalleri içermemesi gerekir. Damıtık (distile) su için en ideali, cam sistemlerden elde edilen suyun kullanılmasıdır. Taze hazırlanmış saf suyun pH’sı 6,5-7,5 arasında olmalıdır.

Metil Red (MR) Testi Metil kırmızısı reaksiyonu besiyerindeki glukozun bakteriler tarafından fermentatif metabolizasyonu sonucu oluşan organik asitlerin ortamın pH’sını düşürdüğünü ortaya koyar. Metil red solüsyonu pH 6.0’da sarı, pH 4.4’ün altında ise kırmızı renk verir. Besiyerine bakteri ekildikten sonra kültürler 37°C’de 1-7 gün inkube edilir. Bu sürenin sonunda tüp içerisine 4 damla metil red solüsyonu damlatılır ve tüp iyice karıştırılır. Kırmızı renk oluşumu pozitif, sarı renk oluşumu negatif reaksiyonu gösterir. Testte kullanılan besiyeri için 5g pepton, 5g K2HPO4, 5g D-glukoz tartılarak distile suyla 1000ml’ye tamamlanır. Bu bileşenler sıcak distile su içerisinde eritildikten sonra pH 7.2’ye ayarlanır test tüplerine 5 ml hacminde paylaştırılır. Besiyerleri otoklavda 121°C’de 15-20 dakika sterilize edilir. Bu şekilde hazırlanan tüpler buzdolabına uygun kaplar içerisinde kaldırılır. Kullanılmadan önce içerisine test edilecek steril karbonhidrat (0.5 ml) katılır.

Koagulaz Testi Test patojenik stafilokokların belirlenmesinde kullanılan enzimatik bir testtir. Testte reaktif olarak taze hazırlanmış ya da ticari olarak dondurularak kurutulmuş tavşan plazması kullanılır. Tavşan plazması bazı türler (patojenik) tarafından sentezlenen stafilokokal koagulaz enzimi tarafından fibrine dönüştürülen fibrinojeni içerir. Koagulaz stafilokoklarda iki farklı halde bulunur: Bağlı koagulaz ve serbest koagulaz. Bağlı koagulazın varlığı lam koagulaz testi ile, serbest koagulazın varlığı ise tüp koagulaz testi ile gerçekleştirilir. Lam koagulaz testinde bir öze dolusu stafilokok kültürü bir mikroskop lamı üzerien konan distile suda emülsifiye edilir.