BAKTERİYOLOJİK LABORATUVAR YÖNTEMLERİ

Fiksasyon: Bakterilerin lamda tespit edilmesi, lama sabitlenmesi.

Mikroskobik inceleme yapılmadan önce mikroskop lamları temiz ve yumuşak bir bez ile silinmeli ve bek alevinden geçirilerek üzerindeki olası yağ tabakası uzaklaştırılmalıdır. Bunun dışında, lamlar sıvı temizleyici ile yıkanıp, durulanıp, kuru temiz bir bez ile kurulanarak da incelemeye hazır hale getirilebilir.

Mikrobiyolojide kullanılan boyama yöntemleri 2 gruba ayrılır.

1. Basit Boyama Yöntemleri
2. Bileşik Boyama Yöntemleri

Negatif boyama: Bu boyama yönteminde mikroorganizmalar yerine saha boyanır. Karanlık olan sahada mikroplar renksiz veya parlak olarak görülürler. Boya olarak nigrosin veya çin mürekkebi kullanılır.

Gram boyama: Gram boyama yöntemi laboratuvarlarda en yaygın olarak kullanılan bakteriyolojik teşhis yöntemidir.

Ziehl-Neelsen Boyama: Tüberküloz etkenlerinin (mikobakteriler) hücre duvarında fazla miktarda balmumu tabakasının bulunmasından dolayı bu bakterilerin diğer boyama yöntemleri ile boyanması mümkün olmamaktadır. Bu nedenle boya içerisine fenol konur ve alttan hafifçe ısıtılarak balmumu tabakası yumuşatılarak bakterinin boyayı alması sağlanır. Boya içeriye alındıktan sonra asit alkolde bakteri dekolore olmaz ve boyayı bırakmaz. Bu yöntemde, preparat hazırlanır, kurutulur ve tespit edilir.

Bakteri türleri kendilerine özel renk, koku, büyüklük ve yapıda koloniler meydana getirirler. Bu özellikler hücrenin genetik kontrolü altında şekillenirler. Büyüklüğüne göre değişmek üzere bir kolonide milyonlarca veya milyarlarca bakteri hücresi bulunabilir.

Besiyerleri bakterilerin üretilmesinde kullanılan, bakterilerin ihtiyaç gösterdikleri besin maddelerini, kimyasal maddeleri, indikatör maddeleri ve katkı maddelerini içeren katı ve sıvı formdaki ortamlardır.

Agar: Besiyerlerinin katı hale getirilmesi için en çok kullanılan jelleştiricidir. Çoğu kez diğer agarlı besiyerleri ile karıştırılmaması için “agar agar” olarak anılır. Agar deniz yosunlarından elde edilir. Agarın katılaştırma (jelleştirme) özelliğini bileşimindeki D-galakton sağlar. Bileşiminde ayrıca inorganik tuzlar, çok az miktarda protein benzeri maddeler ve eser miktarda yağ vardır.

Beyin ekstraktı: Beyin ekstraktı (brain extract) ve kalp ekstraktı (heart extract) streptokoklar, pnömokoklar, meningokoklar, gonokoklar vb. gibi nazlı üreyen (fastidious) patojen bakterilerin üretilmesi için Brain Heart Buyyon ve Brain Heart Infusion gibi isimlerle anılan besiyerlerinin bileşimine katılır. Ayrıca, çeşitli toksin testleri için patojenlerin bu besiyerinde geliştirilmesi önerilmektedir.

Pepton terimi, proteinlerin hidrolizi ile elde edilen ürünlere verilen genel isimdir. Yaşayan tüm hücrelerde olduğu gibi mikroorganizmalar da azot, karbon, tuzlar ve diğer besin maddelerine gereksinim duyarlar.

Besiyerlerinin hazırlanmasında deterjan ve diğer kimyasallardan arındırılmış temiz cam malzeme kullanılmalıdır. Her zaman için camda distile edilmiş su kullanılmalıdır, çünkü bu şekilde distile edilmiş su bakteriler için inhibitör olan klor ve ağır metal iyonlarını içermemektedir. Hazırlanacak olan besiyeri final hacminin iki katı hacimdeki cam erlen içerisinde hazırlanmalıdır. Otoklavlandıktan sonra agar içeren besiyerleri cam petrilere dökülmeden önce 50°C’ye önceden ayarlanmış su banyolarında soğutulmalıdır. Dökülen besiyerleri katılaştıktan sonra bunlar tamamen kuruyana kadar oda sıcaklığında ya da birkaç saat boyunca 37°C’lik etüvde tutulmalıdır. Cam petrilerde hazırlanan besiyerleri agar yüzeyleri üste gelecek şekilde 4°C’de buzdolabında ideal olarak buzdolabı poşetlerinde saklanmalıdır.

MacConkey agarda üremenin olup olmaması ve/veya karakteri özellikle de enterobakteri ve diğer Gram negatif bakterilerin identifikasyonunda önemli bir kriterdir. Bu özelliği MacConkey besiyerini diğer besiyerleri arasında öne çıkarır.

Bakteri kültürü, bakterilerin laboratuvar ortamında, izolasyon, identifikasyon, karakterizasyon, tiplendirme, pasajlama, araştırma ve saklama amacıyla canlı (embriyolu tavuk yumurtaları, hücre kültürleri, deney hayvanları) ve cansız [katı besiyerleri (kanlı agar, serumlu agar), sıvı besiyerleri (peptonlu su, nutrient buyyon), yarı-katı besiyerleri (yatık nutrient agarlar)] ortamlarda üretilmesidir.

Ekimi yapılacak olan örnek bir doku parçası ise bu öncelikle steril bir cam petri içerisine konur. Daha önceden %70’lik alkol içerisinde tutulan pens ve bistüri bekte flambe edilir ve soğutulur. Doku özellikle de lezyonlu bölgenin kenarından bistüri ile dikkatlice kazınır. Bu kazıntılardan bir miktar ekimi gerçekleştirilecek besiyerinin kenarına bırakılır. Eğer ekimi gerçekleştirilecek klinik materyal sıvı ya da yarı-sıvı karakterde ise bu besiyerinin uç kısmına bir steril svap yardımıyla örneklenerek svabı kendi ekseni etrafında çevirerek (bu işlem besiyeri yüzeyinde homojen bir örnek dağılımı sağlar) yayılır. Genel bir kural olarak besiyerlerine inokulasyon veya öze ile ekim yapılırken öncelikle inhibitör özellikte olmayan besiyerinden (Örn. Kanlı agar) ekime başlanır, daha sonra inhibitör veya selektif özellikte besiyeri (Örn. MacConkey agar) ile ekimlere devam edilir.

Katı besiyerlerine öze ile ekimin amacı koloni morfolojisinin gözlenmesi, antibiyotik duyarlılık testleri ve biyokimyasal identifikasyon için bakteri kolonilerinin tek tek ve izole bir şekilde elde edilmesidir. Bu amaçla teşhis için laboratuvara gönderilen çoğu materyalden agarın tamamı kullanılarak yapılan bu ekime tek koloni ekimi adı verilmektedir.

Mikroaerofilik atmosferde (%5-10 CO₂) üreyen mikroorganizmalara örnek olarak Brusella türleri, Francisella tularensis, Hemofilus türleri, Taylorella equigenitalis gibi bakteriler verilebilir.

Hızlı üreyen bakterilerin çoğu 24-48 saat içerisinde, hızlı üreyen bakteriler selektif besiyerlerinde üretildiklerinde 48-72 saat içerisinde, Brusella türleri, Kampilobakter türleri, Nocardia asteroides, bazı Mikoplazma türleri 4-6 günde, Mycobacterium bovis 3-8 haftada, Mycobacterium paratuberculosis 4-16 haftada üremektedir.

Durham tüpü: Karbonhidrat fermentasyon testlerinde, besiyerinde gaz çıkışının belirlenmesi amacıyla standart test tüpünün içerisinde ters (baş aşağı) olarak konulan küçük tüp.

Nitrat Redüksiyon Testi
Bu test mikroorganizmaların nitratları redükte edebilme yeteneğini belirlemede kullanılır.

İndol Testi bakterilerin bir aminoasit olan triptofanı ayrıştırarak indol meydana getirebilme yeteneğini belirlemek için kullanılır. Aynı zamanda bakterilerin cins [(Salmonella (-), Edwardsiella (+), E. coli (+), Klebsiella (-), Enterobakter (+)] ve
tür düzeyinde [Pasteurella multocida (+), Mannheimia haemolytica (-), Proteus mirabilis (-), P. vulgaris (+)] ayrımında işe yarar. 

Test 2 farklı metot ile uygulanabilir. İlkinde kanlı agardaki bakteri kolonilerinin üst kısmından bir öze ile alınarak temiz bir mikroskop lamına konur ve bunun üzerine %3’lük hidrojen peroksit eklenir. Birkaç saniye içerisinde oksijen gazına bağlı kuvvetli köpürme pozitif reaksiyona işaret etmektedir. İkinci metotta ise katı besiyerinde üremiş bakteri kolonisi üzerine hidrojen peroksit damlatılır. Kuvvetli köpürme pozitif reaksiyona işaret eder.

Koagulaz Testi
Test patojenik stafilokokların belirlenmesinde kullanılan enzimatik bir testtir.

Bu test kitleri günümüzde birçok ticari firma tarafından üretilmektedir ve biyokimyasal testlerin minyatürize edildiği şeritler halindedir. Enterobakterilerin, Gram negatif bakterilerin, anaerobların, non-fermentatif bakterilerin, streptokokların, stafilokokların, diğer Gram pozitif bakterilerin identifikasyonuna yönelik ticari test kitleri bulunmaktadır. Bu şeritler halindeki biyokimyasal testler yukarıda bahsedilen konvansiyel formları ile test sonuçları açısından iyi derecede uyumluluk göstermektedir. Bu test sistemlerinin avantajları inokulasyonun yapıldığından emin olunması, sağlanan besiyeri ve reaktiflerin kullanıma hazır olması ve test sonuçlarının kolay ve hızlı bir biçimde değerlendirilmesine olanak sağlamasıdır.