SEROLOJİ

Seroloji kelimesinin tam karşılığı “serum bilimi”dir.

Serolojik testler çeşitli amaçlarla kullanılabilmektedir. Bu amaçları şöyle sıralayabiliriz;
• İnfeksiyöz hastalıkların tanısı,
• Aşı programlarının düzenlenmesi amacı ile aşılama öncesi maternal antikor düzeyinin belirlenmesi ve aşı uygulamalarından sonra koruyucu bağışıklığın saptanması,
• Humoral immun yetmezliklerin belirlenmesi,
• Vucut dokularında veya kan, lenf vb. vucut sıvılarında antijen varlığının saptanması,
• Antijen ve antikor moleküllerinin tiplendirilmesi

Antikor ve antijen moleküllerinin tam olarak reaksiyona girdiği bu optimal düzeye “equivalan zon” adı verilir.

ELISA’da antikor veya antijen moleküllerini işaretlemek için en fazla kullanılan enzimler horseradish peroksidaz, alkalin fosfotaz ve b-galaktosidaz’dır. 

Bu yöntemde; ilk aşamada aranan antikora spesifik bilinen antijenin polisteren yüzeylere bağlanması sağlanır. Bağlanmamış antijenler yıkama işlemi ile uzaklaştırılır. Ardından şüpheli serum eklenir ve uygun bir süre inkübe edilir. Bu dönemde eğer şüpheli serumda antikor varsa antijen ile spesifik olarak bağlanacaktır. Yıkama işlemi tekrar uygulanır, antijenle bağlanmış antikorlar ortamda kalırken bağlanmamış antikorlar uzaklaştırılır. Bu aşamada antijen antikor bağlanmasını ortaya koymak için ortama enzim ile işaretlenmiş anti-immunglobulin (konjugat) eklenir. Eklenen anti immun-globulin, serumu incelenen havyan türüne özgüdür ve bu aşamada şüpheli serumda bulunan antikorlara bağlanır. İnkübasyondan sonra tekrar yıkama işlemi uygulanarak bağlanmamış maddeler uzaklaştırılır. Son olarak uygun enzim substratı katılarak oluşan reaksiyonun görülebilir olması sağlanır. Burada beklenen; katı yüzeye bağlanmış enzim işaretli anti-immunglobuline substratın etki ederek renk değişikliği ile reaksiyonu ortaya çıkarmasıdır. Eğer şüpheli serumda antikor yoksa, ilk aşamadaki antijenle bağlanmayacak ve yıkama işlemleri ile daha sonraki aşamada katılan maddeler de ortamdan uzaklaştırılacağı için substrat katıldıktan sonra renk değişikliği olmayacaktır.

Bu yöntemde antijen arandığı için ilk aşamada polisteren yüzeylere aranan antijene spesifik antikor kaplanır. Ardından antijen şüpheli test örneği (vucut sıvıları vb.) ortama eklenir. İnkübasyon periyodu ve yıkama işleminin ardından üçüncü aşamada aranan antijene spesifik antikor katılır, inkübasyon ve yıkama işlemi uygulanır. Dördüncü aşamada spesifik antikora karşı oluşturulmuş enzimle işaretli anti-immunglobulin (konjugat) eklenir. İnkübasyon ve yıkama işlemlerinin ardından son aşamada substrat katılarak test tamamlanır. Şüpheli test materyalinde antijen varsa, katı yüzeye bağlı olan spesifik antikor ile bağlanacağından ardından katılan diğer maddelerde aynı ilke ile birbirleri ile reaksiyona girerek katı yüzeye tutunacaktır ve son aşamada substratın katılması ile renk değişikliği görülecektir.

İmmunof­luoresan (IF) teknikleri, antijen veya antikor moleküllerinin fluoresan boyalar ile işaretlenmesi ve oluşan spesifik antijen-antikor reaksiyonlarının ultraviole (UV) ışığı altında fluoresan parlamalar ile gösterilmesi esasına dayanır.

RIA, antijen veya antikor moleküllerinin radyoizotoplarla işaretlenmesi ve oluşan spesifik antijen-antikor reaksiyonlarının açığa çıkardığı radyoaktivitenin özel cihazlarla (gama-counter) ölçülmesi esasına dayanan teknikleri içerir. Antijen veya antikor moleküllerini işaretlemek için genellikle iyot-125, karbon-14 gibi radyoizotoplar kullanılır. RIA antijen veya antikor saptamak amacı ile kullanılmaktadır. Bu tekniklerin başlıca kullanım alanları; vucut sıvılarında düşük düzeylerde bulunan ilaç, hormon, enzim aranması, allerjik bireylerde allerjene spesifik IgE saptanmasıdır. ELISA ve IFA tekniklerine benzer şekilde uygulanan farklı yöntemleri vardır. Diğer primer bağlanma testlerine göre çok daha duyarlı olmasına rağmen, RIA uygulayanlar için radyoaktivite nedeni ile sağlık riskleri taşıması, özel cihazlara gereksinim göstermesi ve maliyetlerinin yüksek olması nedeni ile günümüzde özel araştırma laboratuarları dışında fazla tercih edilmemektedir.

İkincil bağlanma testlerinde, eriyebilir özellikte olan antijenler ile homolog antiserumun bir araya gelmesi ile oluşan reaksiyonlara “presipitasyon” adı verilir. 

Tek Yönlü İmmunodif­fuzyon Tekniği: “Oudin Yöntemi” olarak da bilinir. Bu yöntemde, şüpheli serum sıvı haldeki agaroz jele karıştırılarak agar tüpte soğumaya ve katılaşmaya bırakılır. Agar katılaştıktan sonra sıvı haldeki antijen tüpün yüzeyine ince bir katman olarak eklenir. Antijen yarı katı agarın yüzeyinden tüpün dibine doğru dif­fuzyon ile yayılır ve agar içinde bulunan şüpheli serumda eğer antikor varsa antijen ile karşılaştığı yerde presipitat çizgileri oluşturur. Bu teknik ile sadece bir antijen antikor reaksiyonu incelenebilir.

Aglutinasyon, partiküler yapıdaki antijen ile homolog antiserumun bir araya gelmesi sonucu oluşan reaksiyonlara verilen isimdir.

Çabuk Lam Aglutinasyon Testi: Lam üzerinde uygulanan ve birkaç dakika gibi kısa sürede yanıt veren testlerdir. Bu teknikte bir öze dolusu yoğun bakteri suspansiyonu bir öze dolusu yoğun antiserum ile bir lam üzerinde bir araya getirilerek karıştırılır ve homojenize edilir. Pozitif reaksiyon aglutinasyon sonucu birkaç dakika içinde oluşan tipik granüllerin gözlenmesi ile saptanır.

Bazı viruslar memeli veya kanatlı eritrositlerine bağlanarak kümelendirme ve aglutine etme özelliğine sahiptir. Hemaglutinasyon (HA) olarak tanımlanan bu özellik serolojik bir reaksiyon değildir ve sadece bu özelliğe sahip virusların karakterizasyonu amacı ile kullanılır.

Viral HA testi; virusların tanımlanması ve HI testinde kullanılacak virusun (antijenin) HA titresini saptanması olmak üzere başlıca iki amaçla uygulanır.

Çabuk Lam HA Testi: Virusların identifikasyonu amacı ile uygulanan bu testte, temiz bir lam üzerine bir damla %2’lik eritrosit konur ve üzerine bir damla antijen eklenir. Birkaç saniye içinde gözlenen kümeleşmeler pozitif olarak değerlendirilir.

Komplement antijen-antikor reaksiyonlarına katılarak hücre lizisine neden olan bir serum proteinidir. Örneğin bir eritrosit hücresi ile spesifik antikor bir araya getirilirse ve ortamda komplement varsa antijen(eritrosit)-antikor kompleksine bağlanan komplement eritrositi lize eder.

Komplement fikzasyon testinin yorumlanması: Şüpheli serumda antikor varsa; ilk aşamada bilinen antijen ile şüpheli serumdaki antikorlar reaksiyona girecek ve ortamdaki komplement de bu reaksiyona katılarak kullanılacaktır. İkinci aşamada ortama katılan hemolitik sistemde komplement etkili olamayacağından hemoliz görülmeyecektir. Diğer bir ifade ile hemolizin görülmemesi sonucun pozitif olduğunun (serumda antikor bulunduğunun) göstergesidir. Şüpheli serumda antikor yok ise; ilk aşamada bilinen antijen ile reaksiyona girecek antikor olmayacağından ortamdaki komplement de kullanılmayacaktır. İkinci aşamada ortama katılan hemolitik sisteme ilk aşamada kullanılmamış olan komplement de katılarak koyun eritrositlerini lize edecektir. Sonuçta hemolizin görülmesi sonucun negatif olduğunun (serumda antikor bulunmadığının) göstergesidir.

Yavaş Tüp HA Testi: Antijenin iki katlı dilusyonları yapılarak ardından bütün tüplere eşit miktarlarda %1-2’lik eritrosit suspansiyonundan eklenir. Oda sıcaklığında 30-45 d. inkubasyona bırakılır. Pozitif reaksiyonda tüpün dibinde dantela şeklinde bir çökelti oluşur. Pozitif reaksiyonun gözlendiği en yüksek antijen sulandırması belirlenir ve incelenen infeksiyonun özelliğine göre standart HA ünitesi de dikkate alınarak antijenin (virusun) HA titresi hesaplanır. Bu test, HI testi öncesinde antijenin HA titresinin belirlenmesi amacı ile uygulanır. Günümüzde pratik olması açısından HA ve HI testleri mikropleytlerde uygulanmaktadır.

Test iki aşamalı olarak uygulanır:
• İlk aşamada; şüpheli serum-bilinen antijen ve komplement kaynağı olarak kobay serumu bir araya getirilir ve inkübe edilir. Testte komplement kaynağı olarak kobay serumunun kullanılmasının nedeni, içerdiği komplementin koyun eritrositlerini lize etme özelliğidir. Kullanılan kobay serumu taze ve önceden titre edilmiş olmalıdır.
• İkinci aşamada; inkubasyon süresi sonunda ortama “hemolitik sistem” olarak koyun eritrositi (antijen) ve tavşanda koyun eritrositlerine karşı elde edilmiş antikor (amboseptör) eklenir ve tekrar inkübe edilir.

Koruma (Proteksiyon) Testleri: Koruma testleri nötralizasyon testleri ile aynı temele dayanır ancak tamamen canlı ortamda uygulanması yönü ile farklılık taşır. Koruma testlerinde deney hayvanlarına önce koruma özelliği saptanacak olan spesifik antiserum farklı dilusyonlarda verilir. Ardından hayvanlar standart dozda bilinen patojenik mikroorganizma veya toksin ile eprüve edilir. Gözlem altında tutulan hayvanlarda ölüm veya hastalık oluşup oluşmadığı incelenir. Şüpheli serumdaki antikor varlığı ve düzeyine bağlı olarak deneme gruplarında yer alan hayvanlarda ölüm/hastalık gibi değişiklikler gözlenir. Koruma testlerinde kullanılan deney hayvanlarında infeksiyonlara duyarlılık, antiserum emilimi gibi çeşitli faktörler bireysel değişkenlik gösterebilir. Bu durum testlerin duyarlılığını olumsuz etkileyen faktörlerdir. Bu olumsuzlukları gidermek için lisanslı deney hayvanları ünitelerinden mümkün olduğunca çok sayıda hayvan temin edilmesi ve testlerde kullanılacak mikroorganizma veya toksinlerin eprüve edilen dozlarının iyi standardize edilmesi gereklidir.