TEMEL VETERİNER HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ

Tespit Amacı ile Kullanılan Kimyasal Maddeler: Formaldehid, Glasiyal asetik
asit, Etil alkol, Merküri klorür, Pikrik asit, Potasyum dikromat, Aseton, Osmiyum
tetraoksit, Potasyum permanganat, Glutaraldehid

Kimyasal Tespit Aşamasında Üzerinde Durulması Gereken Faktörler
• Tespit solusyonunun amaca göre seçimi: Bütün dokular için ideal olan tek
bir tespit solusyonu yoktur. Örneğin formol sinir doku ve lipidler, etil alkol
karbonhidrat ve proteinler için uygun bir tespit maddesidir.
• Tespit solusyonunun miktarı: Tespit sıvısının miktarı ile bu sıvı içinde
doku takibi yapılacak materyalin miktarı önemlidir. Tespit sıvısı içine çok fazla doku örneği konulursa etken madde az geleceği için iyi bir tespit elde
edilemez. Fazla miktarlarda tespit solusyonu kullanılması hem laboratuvarlarımızın ekonomisi hem de kimyasal atık miktarımızı artırması açısından tercih edilmez. Bu nedenle 1:50 - 1:25 oranları tercih edilebilir.
• Tespit solusyonunun PH’sı: Kullanılacak tespit solusyonu ile ilgili özel bir
uyarı olmadığı sürece pH ölçümüne gerek yoktur.
• Tespit süresi: Doku örneklerinin tespit solusyonu içinde bırakılma süresi, örneğin büyüklüğü, ortam ısısı, tespit solusyonunun difüzyon gücü gibi
faktörlere göre değişir. Ayrıca tespit edilen dokunun yapısal özelliği de tespit süresi üzerinde etkilidir. Organ kapsülü gibi bağ doku unsurları tespitin
doku içine yayılımını zorlaştırabilir. Uygun büyüklükte alınan doku parçaları, oda ısısında 12 -24 saatte tespit olabilir.
• Doku parçasının büyüklüğü: Amacımıza en uygun biçimde olabildiğince
küçük örnekler alınmalıdır. 1 cm3’ den büyük olmamasına özen gösterilmelidir.
• Ortam ısısı: Ortam ısısı azaldıkça tespit süresi uzar. Teknikte özellikle belirtilmedikçe en uygun ortam ısısı oda sıcaklığıdır (20 °C). Histokimyasal
çalışmalarda 0 - 4 °C tercih edilir.
• Tespit solusyonunun difüzyon gücü: Dokuya süratle yayılabilen tespit
maddeleri tespit süresini kısaltır ve dokunun canlılıktakine en yakın formda kalmasını sağlar.
Tespitten sonra su ya da dereceli alkoller ile yıkama yapılarak tespite ait kalıntıların uzaklaştırılması sağlanır. 

Suyunu giderme: Aynı zamanda dehidrasyon da denir. Dokuların büyük bir
bölümünü su oluşturduğu için %50’den başlayarak %100’e kadar dereceli etil alkoller ile dokunun suyu alınır. Etil alkolün dereceli olarak kullanılmasının nedeni
dokular üzerindeki büzücü etkisinden dolayıdır. Dehidrasyon için tetrahidrofuran, aseton, dioksane ve isopropil alkol gibi kimyasallarda kullanılabilir.
Parlatma: Dokuları saydam (transparan) hale getirmek için yapılan işlemdir.
Aynı zamanda dokudaki alkoller de giderilir ve emdirmede kullanılan maddeye
uyum sağlanır. Bu amaç için en yaygın kullanılan madde xylol olmakla birlikte
benzen, toluen, chloroform, methylbenzoat, sedir yağı da kullanılabilir.

Emdirme: Suyu giderilmiş ve saydam duruma gelmiş doku parçalarına gömme
materyali olarak kullanacağımız parafin veya paraplastın emdirilmesidir. Ticari
olarak satılan parafinlerden 40 °C de eriyen yumuşak 58- 60 °C’de eriyen ise sert
parafin veya paraplasttır. Parafinin dokulara kolay ve derinlemesine işlemesini
sağlamak için vakumlu etüv ortamı tercih edilmelidir

Bazı bazik boyalar reaksiyona girdikleri doku komponentlerini normal renklerinden farklı, maviden kırmızı ve mora değişen tondalarda boyarlar. Bu absorbsiyon değişikliğine Metakromazi denir.

Kriyoprotektan: Dondurma
sırasında dokularda meydana
gelebilecek hasarları önlemek
için kullanılan maddelerdir.

İmmunositokimya: İşaretlenmiş antikorlar ile hücre ve doku antijenlerinin
gösterilmesini sağlayan tamamen antijen antikor spesifikliğine dayanan bir tekniktir

Hücre ve doku kültürü tekniklerinin kullanım alanları:
• Moleküler biyolojinin güncel metodları ve yeni DNA dizilimlerinin tanımlanmasında,
• Normal ve kanserli hücrelerin metabolizmalarının incelenmesinde,
• İnsan ve hayvanların patogen viruslarının epidemiyoloji, teşhis, tedavi ve
mücadeleleri üzerindeki çalışmalarda,
• Viral araştırmalarda, doğal konakçılar dışında üretilemeyen virusların üretilmesinde,

Histokimya: Histolojik kesitlerde doku ve hücre içindeki organik ve inorganik
maddelerin varlığını ve yerleşimini tespit ederek kimyasal yapıyı ortaya koymayı
amaçlayan histoloji tekniğidir.

Civa klorür - Civa klorid (HgCl2): Beyaz kristalize bir maddedir. Doku tespitinde yaygın olarak kullanılan bir tuzdur.

B

Giemsa Wright Boyası:  Kan hücrelerini tanımlamak için kullanılmaktadır.

Otoradyografi: Doku içinde yer alan radyoaktif materyali bir doku kesiti aracılığı ile üzerinde yer alan fotoğraf emülsiyonuna aktaran metoddur.

Hücre ve hücrelerarası maddeyi canlılığın sona erdiği andaki yapısal özellikleri ile korumak için yapılan işleme tespit (fikzasyon) denir.

Paraformaldehid: Özellikle elektron mikroskop çalışmalarında, rutinde cerrahi ve otopsi materyalinin tespitinde tercih edilir.

Parlatma: Dokuları saydam (transparan) hale getirmek için yapılan işlemdir. Aynı zamanda dokudaki alkoller de giderilir ve emdirmede kullanılan maddeye uyum sağlanır.

Yanlış bilgi içeren seçenek E şıkkı olan "Anilin Blue- Asidik- Yeşil" şeklindedir.

Reaksiyon rengi yeşil değil, mavi olmalıdır.

Kriyoprotektan: Dondurma sırasında dokularda meydana gelebilecek hasarları önlemek için kullanılan maddelerdir.

Histoloji Tekniğinde Temel Aşamalar
• Materyalin(doku örnekleri) alınması

• Tespit (fikzasyon) ve yıkama
• Suyunu giderme (dehidrasyon)
• Parlatma veya saydamlaştırma
• Emdirme
• Gömme veya bloklama (blokaj)
• Kesme (kesit alma) ve lama yapıştırma
• Boyama ve kapatma

Histoloji bilimi, rutin incelemelerde ışık mikroskopi tekniğini detaylı incelemelerde ise daha yüksek büyütme gücüne sahip elektron mikroskop tekniğini kullanır. Histoloji tekniğinin temelleri ışığı geçiremeyecek kadar kalın olan organ ve doku parçalarından ışığı geçirebilecek incelikte kesitler almak ve canlıda renksiz olan doku unsurlarını boyayarak mikroskop altında görülebilir hale getirmektir. Kısaca hücre ve hücrelerin oluşturduğu dokuların yapısal özelliklerinin mikroskop altında incelenebilir hale getirilmesini sağlayan preparat hazırlama yöntemlerine Histoloji Tekniği adı verilir. Histoloji tekniği uygulanan dokular genel olarak cansız incelenir, bazı dokuları ise vital boyalar aracılığı ile canlı olarak incelemek mümkündür. Mezenteryum, kurbağa yavrusunun kuyruğu, Hamster’in yanak kesesi ve spermatozoon canlı olarak incelenebilir. Cansız olarak incelenecek bir dokuya uygulanması gereken işlemler öncelikle kullanmış olduğunuz tespit yöntemine göre farklılıklar göstermektedir. Hücre ve hücrelerarası maddeyi canlılığın sona erdiği andaki yapısal özellikleri ile korumak için yapılan işleme tespit (fikzasyon) denir. Güncel anlamda mumyalamak, konserve yapmak ya da dondurmak da bir tür tespit işlemidir. Canlıdan uzaklaşan ve bütünlüğü bozulan dokular bakteriler ve lizozomlarda bulunan enzimler tarafından süratle yıkımlanır bu olaya otoliz adı verilir. Tespit işlemi ile amacımız otolizi engellemektir. Histoloji laboratuarlarında kullanılan farklı tespit yöntemleri vardır.

Tespit Yöntemleri:
I- Fiziksel tespit: Isıtma veya kurutma, frotilerin veya yayma kesitlerin etüv ya da mikrodalga fırında ısıtılarak kurutulması ile yapılır.
Dondurma, doku örneklerinin süratle dondurulması ve dondurma mikrotomu ya da cryotom adı verilen özel cihazlar aracılığı ile kesitler alınması esasına
dayalı bir yöntemdir. Laboratuar süreci kısa olduğu için teşhis amaçlı olarak histopatoloji laboratuarlarında tercihen kullanılır. Ayrıca histolojide özel inceleme
yöntemlerinin bir bölümünde spesifik olarak kullanılır.
II- Kimyasal Tespit: İncelenecek doku örneklerine kimyasal madde ya da madde karışımlarını uygulayarak yapılan tespit yöntemidir. Tespitin uygulanış şekline göre ikiye ayrılır:
Perfüzyon tespiti: Anestezi altındaki canlının göğüs boşluğu açılır, kalbin sol
ventrikulusundan girilerek belli bir basınç ile serum fizyolojik verilir, sağ atriumda açılan karşı bir delikten serum fizyolojik boşalana kadar bu işleme devam
edilir. Serum fizyolojik gelmeye başladıktan sonra aynı noktadan aynı yöntemle tespit solüsyonu verilmeğe başlanır (PH: 7.4). Canlı tamamı ile tespit olana dek bu
işleme devam edilir (tespit olduğunu ekstremitelerin gerilmesi, burun ucu ve mukozaların tespit solüsyonunun rengini almasından anlayabiliriz). Bu tespit yöntemi total perfüzyondur. Aynı işlem tek bir organa giren ve çıkan damarlar aracılığı ile yapıldığında organ perfüzyonu olur.
Daldırma (İmmersiyon) tespiti: En fazla kullanılan tespit yöntemidir. Canlıdan anestezi altında alınan doku örnekleri ya da biyopsi ile alınan materyale kimyasal
tespit (fikzatif) içeren cam kavanozlarda takip işlemi uygulanır. Bu işlem sırasında uygulanan kimyasallar dokuları sabitleyici ya da proteinler ile çapraz bağlar oluşturucu bir etki gösterir. Tespit amacı ile kimyasal maddeler tek olarak kullanılabildiği gibi, değişik oranlarda karışım olarak hazırlanan solusyonlar aynı anda
farklı amaçları karşılayabildiği için tercih edilebilir.

Histoloji Tekniğinde Temel Aşamalar
• Materyalin(doku örnekleri) alınması
• Tespit (fikzasyon) ve yıkama
• Suyunu giderme (dehidrasyon)
• Parlatma veya saydamlaştırma
• Emdirme
• Gömme veya bloklama (blokaj)
• Kesme (kesit alma) ve lama yapıştırma
• Boyama ve kapatma